인간 눈물 샘플의 사이토카인을 분석하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 분석

초록

출처: Balne, P. K., et al. Tear 사이토카인 프로파일 분석을 위한 비드 기반 멀티플렉스 분석. J. Vis. 특급 (2017년)

이 동영상은 인간 눈물의 사이토카인을 분석하기 위한 비드 기반 멀티플렉스 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 단일 샘플에서 여러 사이토카인을 동시에 분석할 수 있어 다양한 병태생리학적 조건에서 면역 반응을 연구하기 위한 감도를 높일 수 있습니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 눈물 사이토카인 분석

1. 눈물의 수집:
   1. 피험자에게 검사 의자에 편안하게 앉아서 머리를 머리 받침대에 대도록 요청합니다.
   2. 피험자에게 위를 올려다보라고 하고, 쉬르머 스트립(왓만 여과지 41번으로 제작)을 조심스럽게 열고, 스트립의 둥근 끝을 눈의 아래쪽 앞부분에 대고, 피험자에게 5분 동안 눈을 감으라고 지시한다. 눈물을 모으는 동안 안구 표면 접촉을 최소화하도록 세심한 주의를 기울이십시오.
   3. 피험자에게 눈을 뜨게 하여 스트립을 제거하고 멸균된 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣으라고 합니다. 즉시 튜브를 실험실로 옮기거나 사이토카인 프로파일링을 테스트할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
2. 눈물 흐름 스트립에서 눈물 샘플의 용출:
   1. 눈물 흐름 스트립을 0.5cm 길이로 자르고(테스트할 눈물의 양을 표준화하기 위해) 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
   2. 30μL의 분석 완충액을 추가하고 실온에서 5분 동안 배양한 다음 14,000 x g에서 1분 동안 튜브를 원심분리합니다.
   3. 상층액을 다른 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 스트립을 폐기합니다. 튜브가 들어있는 샘플을 얼음 위에 놓고 사이토카인 프로파일링을 위해 용출된 눈물 샘플을 즉시 사용합니다.
3. 시약의 준비 :
   참고: 비드 기반 멀티플렉스 분석으로 각 샘플에서 테스트할 41개의 분석물은 인터류킨(IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, 인터페론-알파(IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-감마 유도 단백질 10(IP-10, CXCL10), 대식세포 유래 케모카인(MDC), 대식세포 염증 단백질(MIP)-1α 및 MIP-1β, 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, MCP-3, 종양괴사인자-알파(TNF-α), TNF-β, 성장조절 종양유전자(GRO), 종양성장인자알파(TGF-α), 혈관내피성장인자(VEGF), 표피성장인자(EGF), 섬유아세포성장인자(FGF)-2, 혈소판 유래 성장인자(PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, 과립구 집락자극인자(G-CSF), 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF), 에오탁신, 프라크토킨, 용해성 CD40 리간드(sCD40L), Fms-like 티로신 키나아제 3 리간드(Flt-3L) 및 활성화 시 조절, 정상 T 세포 발현 및 분비 단백질(RANTES).
   1. 항체 비드 용액(50X) 바이알을 실온(20 – 25 ^oC)으로 가져오고 바이알을 1분 동안 볼텍스합니다.
   2. 분석에 필요한 웰 수를 계산하고 분석에 필요한 총 항체 비드 칵테일 용액(웰당 25μL)과 각 항체 비드 용액(50X)의 양을 계산합니다.
   3. 계산된 양의 각 항체 비드 용액을 첨가하여 칵테일 용액을 준비하고 남은 양의 비드 희석제를 추가하여 원하는 최종 부피로 채웁니다. 칵테일에 있는 각 항체의 최종 농도가 1X인지 확인합니다. 피펫팅 오류가 발생할 경우를 대비하여 항상 최소 20%의 추가 용량의 칵테일 용액을 준비하십시오.
      메모: 예를 들어, 96-well 분석의 경우 3000μL의 항체 비드 칵테일 용액을 준비합니다. 각 항체 비드 용액의 필요한 양 = 각 항체 비드 용액의 3000/스톡 농도; 3000/50 = 각 항체 비드 용액의 60 μL
      1. 41개의 항체 비드 용액(60 X 41 = 2460 μL) 각각을 60 μL를 칵테일 병에 넣고 540 μL의 비드 희석액을 항체 비드 혼합물에 추가하여 3000 μL의 최종 작업 용액(1X)을 만듭니다.
      2. 사용하기 전에 비드 칵테일 용액을 적절하게 혼합하십시오. 분석 후 남은 부피를 최대 30일 동안 2-8°C에서 보관하십시오.
   4. QC 1 및 QC 2 스톡에 250μL 탈이온수를 첨가하여 품질 관리(QC)를 준비합니다.
   5. 병을 여러 번 뒤집고 10초 동안 와류로 섞어 적절하게 혼합합니다. 용액을 적절하게 라벨링된 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 나머지 용액을 최대 30일 동안 사용할 수 있는 -20°C에서 보관합니다.
   6. 10X 세척 완충액 30mL에 탈이온수 270mL를 첨가하여 세척 완충액을 준비하고 잘 혼합합니다(희석 전에 10X 완충액을 실온으로 가져오고 혼합하여 모든 염 침전물을 용해). 사용하지 않은 세탁 버퍼(1X)는 최대 2일 동안 사용할 수 있는 8-30°C에 보관하십시오.
   7. 스톡 바이알에 250μL 탈이온수를 첨가하여 인간 사이토카인 표준물질 스톡(모든 분석물의 10,000pg/mL)을 준비합니다. 여러 번 뒤집고 바이알을 10초 동안 와류로 섞어 잘 섞습니다. 10분 동안 그대로 두었다가 원액을 적절하게 라벨링된 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 분석 후 남은 용액을 최대 30일 동안 사용할 수 있는 -20°C에서 보관하십시오.
   8. 분석 버퍼를 사용하여 5배 연속 희석(50 μL -> 200 μL)으로 작동하는 인간 사이토카인 표준물질을 준비하여 2000, 400, 80, 16 및 3.2 pg/mL를 얻습니다.
   9. 표준물질 전처리 후 60분 이내에 작업 표준물질을 사용하고 분석 버퍼를 블랭크/백그라운드(-pg/mL)로 사용합니다.
4. 비드 기반 멀티플렉스 분석에 의한 사이토카인 프로파일링:
   1. 모든 시약을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가하기 전에 5-10초 동안 실온과 와류로 가져옵니다. 분석 전에 용리된 눈물 샘플을 -80 ^oC에서 보관한 경우, 얼음과 원심분리기에서 동결된 눈물 추출물을 1000 X g에서 5분 동안 해동합니다.
   2. 인간 사이토카인 표준물질[0 (Blank), 3.2, 16, 80, 400, 2,000 및 10,000 pg/mL], QC1, QC2 및 시료를 작동시키기 위한 수직 구성의 분석 워크시트를 준비합니다.
   3. 플레이트의 각 웰에 200μL의 1X 세척 버퍼를 추가하고 플레이트 씰러로 밀봉한 다음 실온(20-25 ^oC)의 플레이트 셰이커에 10분 동안 보관합니다.
   4. 플레이트를 뒤집고 흡수성 수건에 여러 번 테이프로 붙여서 1X 세척 버퍼를 디캔팅하여 웰에 남아 있는 세척 버퍼를 제거합니다.
   5. 작동하는 각 인간 사이토카인 표준물질, QC1, QC2, 블랭크(분석 버퍼) 및 시료 25μL를 적절한 웰에 추가합니다.
   6. 각 웰에 25μL의 분석 버퍼를 추가합니다.
   7. 각 웰에 25μL의 1X 항체 비드 칵테일 용액을 추가합니다. 항체 비드 용액은 빛에 민감하므로 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하고 알루미늄 호일로 덮어 분석 중에 빛으로부터 보호하십시오.
   8. 셰이커에서 밤새 4 ^oC에서 플레이트를 배양합니다.
   9. 자동 마그네틱 플레이트 와셔의 플레이트 랙에 플레이트를 놓습니다. 1분 동안 그대로 두어 웰 바닥에 마그네틱 비드를 가라앉히고 웰 내용물을 흡인합니다. 웰당 200μL의 세척 버퍼를 추가하고 1분 동안 그대로 둔 다음 웰 내용물을 흡인합니다. 세탁을 다시 한 번 반복합니다(플레이트 세척의 경우 키트 제조업체의 지침을 따르십시오).
   10. 각 웰에 25μL의 검출 항체 용액을 추가하고, 플레이트를 밀봉하고, 알루미늄 호일로 덮고, 셰이커에서 60분 동안 실온에서 배양합니다.
   11. 각 웰에 25μL의 Streptavidin-Phycoerythrin 용액을 추가하고, 플레이트를 밀봉하고, 알루미늄 호일로 덮고, 셰이커에서 30분 동안 실온에서 배양합니다.
   12. 마그네틱 플레이트 와셔에 플레이트를 놓습니다. 1분 동안 그대로 두었다가 웰 내용물을 흡인합니다. 웰당 200μL의 세척 버퍼를 추가합니다. 1분 동안 그대로 두었다가 웰 내용물을 흡인합니다. 세탁을 다시 한 번 반복하십시오.
   13. 각 웰에 150μL의 시스 유체를 추가하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 셰이커에 올려 항체 비드를 재현탁시킵니다.
   14. bead-based multiplex assay plate reader를 사용하여 플레이트를 즉시 판독하고 5-parameter curve-fitting 알고리즘을 사용하여 사이토카인 농도를 분석합니다. tear 사이토카인 프로파일링의 개략적인 흐름도는 그림 1에 나와 있습니다.
5. 분석 플레이트(기기 설정) 및 데이터 분석 읽기:
   1. 비드 기반 멀티플렉스 분석 리더를 켜고 레이저를 30분 동안 예열합니다.
   2. 비드 기반 멀티플렉스 분석 소프트웨어를 실행하십시오. 'Automated Maintenance(자동 유지 관리)' 탭에서 'Calibration-verification(캘리브레이션 검증)' 옵션을 선택합니다. 보정 및 검증 비드의 각 시약 바이알을 30초 동안 소용돌이치게 합니다. 각 시약 5방울을 지정된 웰에 떨어뜨립니다. 지정된 저장통에 탈이온수와 70% 에탄올을 채웁니다.

결과

그림 1: tear 사이토카인 프로파일링의 개략적인 흐름도.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Milliplex MAP 인간 사이토카인/케모카인 마그네틱 비드 패널 -1 키트	Merck, 미국	호시토마그-60K-41
Flexmap 3D Luminex 기기	Luminex Corp, 미국 텍사스주 오스틴
xPonent 소프트웨어	Luminex Corp, 미국 텍사스주 오스틴
RBXGenerator 소프트웨어	BIO-RAD, 프랑스
바이오 플렉스 매니저 6.1	BIO-RAD, 프랑스
플레이트 셰이커	코닝, 미국
TECAN 마이크로플레이트 세척기	Tecan, 스위스	하이드로스피드
피 펫	메틀러 톨레도, 캘리포니아, 미국
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	Axygen, 미국	MCT-150-C
Schirmer 인열 흐름 테스트 스트립	Eye Care and Cure, 미국	101657
Flexmap 3D 캘리브레이션 키트	Luminex Corp, 미국 텍사스주 오스틴	제40-028
Flexmap 3D 검증 키트	Luminex Corp, 미국 텍사스주 오스틴	제40-029
안구 검사 의자