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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 커버슬립에서 배양된 Vero 세포의 SARS-CoV-2 RNA-FISH
1일차
- 세포를 고정하고 투과화(Fixing and pereabilizing cells)
- RT에서 1시간 동안 3.7% w/v PFA 용액으로 감염된 세포를 수정합니다.
- 3.7% PFA 용액을 흡입하고 1x PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.
- PBST 용액으로 세포를 교반과 함께 RT에서 10분 동안 투과시킵니다.
- PBST를 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- 탐지
- 1x PBS 용액을 흡입하고 RT에서 2x SSC로 세포를 두 번 세척합니다.
- 2x SSC 용액을 흡입하고 최소 300μL의 프로브 혼성화 완충액을 추가하여 샘플을 사전 하이브리드화합니다. 세포가 들어있는 웰을 덮고 37 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
- 프로브 혼성화 완충액에 1.2 pmol의 프로브 혼합물을 첨가하여 프로브 용액을 준비합니다.
- 1.2μL의 1μM 프로브 스톡을 사용하여 300μL의 작업 스톡을 준비합니다.
- 사전 혼성화 용액을 제거하고 커버슬립을 가습된 챔버로 옮깁니다.
- 30-50 μL의 프로브 용액을 파라필름에 피펫팅하여 개별 액적을 형성합니다.
- 37 ° C에서 밤새 (12-18 시간) 샘플을 배양하십시오.
2일차
- 커버슬립을 다시 12웰 플레이트로 옮기고 37°C에서 400μL의 프로브 세척 버퍼로 4 x 5분 동안 세척하여 과도한 프로브 용액을 제거합니다.
메모: 배양을 위해 파라필름과 커버슬립 아래에 30-50μl의 분취량을 배치하는 대신 300μL의 프로브 용액을 12웰 플레이트의 커버슬립에 직접 첨가합니다. 이 절차는 더 간단하지만 상당한 양의 시약이 필요합니다. 사용하기 전에 프로브 세척 버퍼를 37°C로 가열하십시오. 필요한 완충액의 양을 계산하고 15mL 코니컬 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- RT에서 5x SSCT로 2 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
- 5x SSCT 용액을 1x PBS로 교체하고 증폭될 때까지 샘플을 4°C에서 보관합니다.
3. 증폭
- 웰에서 1x PBS 용액을 제거하고 각 웰에 최소 300μL의 증폭 완충액을 추가합니다. RT에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
- 각 HCR 헤어핀(h1 및 h2)을 별도의 튜브에서 원하는 부피로 스냅 냉각하여 준비합니다.
- 300μL의 증폭 용액을 준비하려면 각 헤어핀을 18pmol을 사용합니다(예: 300μL의 경우 3μM 스톡 헤어핀 용액 6μL 사용).
- 머리핀 용액을 튜브로 옮깁니다.
- 95 °C에서 90 초 동안 배양합니다.
- 어둠 속에서 30분 동안 RT로 식히십시오.
- 스냅 냉각된 "H1" 및 "H2" 헤어핀을 증폭 버퍼에 추가하여 헤어핀 혼합물을 준비합니다.
- 30-50 μL의 헤어핀 혼합물을 파라필름에 떨어뜨립니다.
- RT에서 어둠 속에서 밤새도록 (12-18 시간) 샘플을 배양하십시오.
3일차
- 커버슬립을 다시 12웰 플레이트로 옮기고 교반과 함께 RT에서 5x SSCT로 5 x 5분 동안 세척하여 과도한 헤어핀을 제거합니다.
- 5x SSCT 버퍼를 흡입하고 1x PBS.
로 교체합니다.
메모: 필요한 경우 표준 면역형광 분석에서 RNA-FISH 샘플을 사용한 다음 핵을 염색합니다(섹션 1.4 참조).
4. 핵 염색 및 슬라이드 장착
- 1x PBS 용액을 흡입하고 1x PBS 용액에서 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, 0.2μg/mL)으로 교체합니다.
- 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
- DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- 장착 매체 각각에 10μL씩 두 방울을 떨어뜨리고, 두 개의 커버슬립을 단일 슬라이드에 놓을 수 있도록 방울이 충분히 분리되었는지 확인합니다.
- 깨끗한 수건에 커버슬립을 두드려 여분의 액체를 제거한 다음 셀이 아래를 향하도록 하여 퇴색 방지 장착 매체에 넣습니다.
- 장착된 샘플을 어두운 곳의 건조하고 평평한 표면에 놓고 경화시킵니다.
- 경화 후 VALAP 실런트 또는 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉하여 샘플이 마르지 않도록 합니다.
2. HAE 배양에서의 SARS-CoV-2 RNA-FISH
1일차
- HAE 문화의 수정 및 침투
- 배지를 흡인하고 RT에서 1시간 동안 3.7% PFA 용액을 사용하여 감염된 세포를 고정합니다.
- 3.7% PFA 용액을 흡입하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- Transwell 인서트 아래에서 3.7% PFA 용액을 1x PBS로 교체합니다.
- PBS를 버리고 s를 탈수합니다.amp-20°C로 예냉각된 100% MeOH로 5 x 20분 세척을 사용하여 les를 만듭니다.
- 두 번째 세척 후 Transwell 인서트 아래의 투과화를 위해 버퍼를 신선하고 냉각된 MeOH로 교체합니다. -20 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
2일차
- 수분 보충
얼음 위에서 등급이 매겨진 일련의 MeOH/PBST 용액(각각 5분간)을 통해 샘플을 재수화합니다: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS 및 100% PBST(2회).
- 50% SSCT/50% PBST를 사용하여 얼음에서 5분 동안 세포를 세척합니다.
- 5x SSCT로 얼음에서 5분 동안 세포를 세척합니다.
- 5x SSCT 버퍼를 1x PBS로 교체합니다.
- 탐지
- 100 μL의 프로브 혼성화 완충액을 사용하여 얼음 위에서 5분 동안 세포(Transwell 인서트 내부)를 배양합니다. 다음으로, 플레이트를 37°C(사전 혼성화)에서 30분 동안 인큐베이터로 옮깁니다.
메모: 프로브 혼성화 버퍼는 사용하기 전에 37°C로 예열해야 합니다. 필요한 부피를 계산하십시오: 단일 Transwell 인서트에 100 μL가 필요합니다.
- 프로브 용액을 준비합니다. 1mL의 프로브 용액에는 4pmol의 프로브가 필요하므로 1mL의 프로브 혼성화 버퍼에 1μL 프로브 스톡 용액 4μL를 추가하고 잘 혼합합니다.
메모: RNA 검출의 경우 Transwell 인서트당 100μL의 프로브 용액을 사용합니다. 사전 하이브리드화 단계가 끝날 때까지 프로브 용액을 얼음 위에 두십시오.
- prehybridization 용액을 제거하고 프로브 용액을 추가합니다.
- 세포를 37 ° C에서 밤새 (12-18 시간) 배양하십시오.
3일차
- 37°C에서 100μL의 프로브 세척 버퍼로 4 x 15분 동안 세척하여 여분의 프로브를 제거합니다.
- RT에서 5x SSCT로 2 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
- 5x SSCT를 1x PBS로 교체하고 증폭될 때까지 샘플을 4°C에서 보관합니다.
- 증폭
- RT에서 30분 동안 증폭 버퍼로 샘플을 배양하여 샘플을 사전 증폭합니다.
- 별도의 튜브에서 원하는 부피를 스냅 냉각하여 각 헤어핀을 준비합니다.
- 500μL의 증폭 용액을 준비하려면 각 헤어핀을 30pmol을 사용합니다(예: 500μL의 경우 3μM 스톡 헤어핀 용액 10μL 사용).
- 헤어핀 용액을 튜브로 옮깁니다.
- 95 °C에서 90 초 동안 배양합니다.
- 어둠 속에서 30분 동안 RT로 식히십시오.
- RT에서 500μL의 증폭 버퍼에 모든 스냅 냉각 헤어핀을 추가하여 헤어핀 용액을 준비합니다.
- 사전 제거amplification 용액을 추가하고 완전한 헤어핀 용액을 추가합니다.
- 어둠 속에서 RT에서 하룻밤(12-18시간) 샘플을 배양합니다.
- 다음과 같이 RT에서 5x SSCT로 세척하여 여분의 헤어핀을 제거합니다: 2 x 5분, 2 x 15분, 1 x 5분.
- 5x SSCT 용액을 1x PBS로 교체하고 4°C에서 2-3일 이상 보관하지 않거나 바로 핵 염색을 진행합니다.
메모: 필요한 경우 표준 면역형광 분석에서 RNA-FISH 샘플을 사용한 다음 핵 염색을 수행합니다(섹션 3 참조).
5. 핵 염색 및 슬라이드 장착
- 1x PBS 용액을 흡입하고 1x PBS의 DAPI 용액(0.2μg/mL)으로 교체합니다.
- 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
- DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- Transwell 인서트의 컷아웃 멤브레인을 셀이 위를 향하도록 하여 10μL의 페이드 방지 마운팅 미디어(medium of 10 μL)에 놓고 멤브레인에 추가 마운팅 미디어(5 μL)를 추가합니다.
- 커버 슬립으로 멤브레인을 덮으십시오.
- 장착된 샘플을 어두운 곳에서 건조하고 평평한 표면에서 경화시킵니다.
- 경화 후 VALAP 실런트 또는 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉하여 샘플이 마르지 않도록 합니다.
3. Vero 세포 및 HAE 배양의 면역 형광 분석
참고: 세포주의 경우 3일째, HAE 배양의 경우 4일째에 면역형광 분석을 수행합니다. 모델마다 다른 접근 방식을 사용합니다. 모든 차이점이 명확하게 표시됩니다.
- 웰에서 1x PBS 용액을 흡입합니다.
- 37°C에서 30분 동안 PBST 용액에 1% w/v 소 혈청 알부민으로 배양하여 샘플을 차단합니다.
- 차단 용액에 적절한 희석액을 준비하여 1차 항체를 준비하고 배양합니다.
- 커버슬립에 있는 Vero 셀의 경우:
- 항체 용액 방울(30-50 μL)을 습도 챔버의 파라필름에 떨어뜨립니다.
- 세포가 아래를 향하도록 하여 항체 방울에 커버슬립을 놓습니다.
- HAE의 경우 인서트의 차단제를 항체 용액(100μL)으로 교체하고 가습된 챔버에서 샘플을 배양합니다.
참고: 1차 항체로 각 배양의 시간과 온도를 조정합니다. 일반적인 매개변수는 RT에서 2시간 또는 4°C에서 밤새도록 사용할 수 있습니다.
- PBST로 3 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
- 커버슬립에 있는 세포의 경우 12웰 플레이트로 옮기고 PBST 용액을 추가합니다.
- HAE 배양의 경우 항체 용액을 PBST 용액으로 교체합니다.
- 컨포칼 현미경에 사용할 수 있는 광원과 필터를 확인합니다.
- 숙주 종에 따라 2차 항체를 선택합니다. 형광단 매개변수(사용 가능한 광원에 따른 여기 및 방출 파장, 스펙트럼 폭 및 여기 효율)를 선택합니다.
메모: 스펙트럼 매개변수는 온라인 도구를 사용하여 모델링할 수 있습니다(재료 표 참조).
- 적절한 2차 항체 용액을 차단 용액으로 희석하여 준비합니다.
- 2 차 항체 (6.3에서와 같이)로 배양하지만 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 3.4단계와 같이 샘플을 세척합니다.
- 핵 염색 및 슬라이드 장착
- 커버슬립에 있는 세포의 경우
- PBST를 흡인하고 1x PBS 용액에서 DAPI(0.2μg/mL)로 교체합니다.
- 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
- DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- 셀이 아래를 향하도록 하여 10μL의 장착 매체 방울에 커버 슬립을 놓습니다.
- 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하십시오.
- HAE 배양의 경우
- 1x PBST를 흡입하고 1x PBS 용액에서 DAPI(0.2μg/mL)로 교체합니다.
- 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
- DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- 세포가 위를 향하도록 하여 10μL의 마운팅 배지 방울에 컷아웃 멤브레인을 놓고 멤브레인에 추가(5μL)의 마운팅 배지를 추가합니다.
- 커버 슬립으로 멤브레인을 덮으십시오.
- 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하십시오.
4. 컨포칼 현미경 검사
- 사용된 형광단을 지정하여 트랙을 정의합니다.
- 스캔 모드와 속도를 선택합니다.
- 각 형광단을 각각의 음성 대조군과 비교하여 레이저 출력, 이득 및 오프셋 값을 조정합니다: 바이러스의 경우 모의 감염 세포, 세포 단백질의 경우 적절한 숙주의 동형 제어 항체로 염색된 샘플
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- 3D 이미지를 획득하려면 z-스택 모드를 활성화하고 상하 및 하한을 설정합니다. 단계 크기/번호를 설정합니다.
메모: 코로나바이러스 영상에 대한 자세한 내용은.