Immuno-RNA Fluorescence In Situ Hybridization을 사용하여 SARS-CoV-2 시각화

초록

출처: Kula-Pacurar, A., et al. Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization을 사용한 SARS-CoV-2의 시각화. J. Vis. 특급 (166), (2020).

이 비디오는 SARS-CoV-2 아게놈 RNA의 공간 분포를 시각화하기 위한 HCR(Hybridization Chain Reaction)-FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)의 적용을 보여줍니다. HCR과 면역형광 기술을 결합하면 단일 세포 수준에서 숙주-바이러스 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

1. 커버슬립에서 배양된 Vero 세포의 SARS-CoV-2 RNA-FISH

1일차

1. 세포를 고정하고 투과화(Fixing and pereabilizing cells)
   1. RT에서 1시간 동안 3.7% w/v PFA 용액으로 감염된 세포를 수정합니다.
   2. 3.7% PFA 용액을 흡입하고 1x PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.
   3. PBST 용액으로 세포를 교반과 함께 RT에서 10분 동안 투과시킵니다.
   4. PBST를 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
2. 탐지
   1. 1x PBS 용액을 흡입하고 RT에서 2x SSC로 세포를 두 번 세척합니다.
   2. 2x SSC 용액을 흡입하고 최소 300μL의 프로브 혼성화 완충액을 추가하여 샘플을 사전 하이브리드화합니다. 세포가 들어있는 웰을 덮고 37 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
   3. 프로브 혼성화 완충액에 1.2 pmol의 프로브 혼합물을 첨가하여 프로브 용액을 준비합니다.
      ....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
설비
컨포칼 현미경 LSM 880	자이스
인큐베이터 Galaxy170R	뉴 브런즈윅	이산화탄소170R-230-1000
자료
15mm×15mm NO. 1 커버 슬립	랩솔루트	7695022
1.5 mL 튜브	FL-메디컬	5.350.023.053
12웰 플레이트	티피(TTP)	92412
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary 항체	인비트로젠
β5-튜불린	산타 크루즈 생명 공학	사우스캐롤라이나-134234
다피	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	D1306 (영어
HCR 증폭 버퍼	분자 기기, Inc	BAM01522	버퍼도 준비할 수 있습니다 doi:10.1242/dev.165753: 추가 정보
HCR 증폭기 B1-h1 Alexa Fluor 647	분자 기기, Inc.	S013922
HCR 증폭기 B1-h2 Alexa Fluor 647	분자 기기, Inc.	S012522
HCR 프로브 혼성화 버퍼	분자 기기, Inc.	BPH03821	버퍼도 준비할 수 있습니다 doi:10.1242/dev.165753: 추가 정보
SARS-CoV-2 Ncapsid용 HCR 프로브 세트	분자 기기, Inc.	PRE134
HCR 프로브 세척 버퍼	분자 기기, Inc.	BPW01522	버퍼도 준비할 수 있습니다 doi:10.1242/dev.165753: 추가 정보
형광 Spectraviewer			스펙트럼 파라미터 모델링
이미지J 피지			z-stack 이미지 획득 및 처리
면역형광(IF)	블로킹	(PBST에서 1% BSA) 37°C에서 30분
	1차 항체 배양	(차단 용액 중 적절한 농도의 항체 용액) 실온에서 2시간 / 4°C에서 하룻밤, 30-50μL	(차단 용액 중 적절한 농도의 항체 용액) 실온에서 2시간 / 4°C에서 야간, 100μL
	1차 항체 세척	(PBST) 실온에서 3 x 5분
	2차 항체 배양	(차단 용액 중 적절한 농도의 항체 용액) 37 °C에서 1 시간, 30-50 μL	(차단 용액에 적절한 농도의 항체 용액) 37 °C에서 1 시간, 100 μL
	2차 항체 세척	(PBST) 실온에서 3 x 5분
	핵 염색	(DAPI 솔루션) 실온에서 10분, 1x PBS로 2 x 5분

) ) (영문)