Immuno-RNA Fluorescence In Situ Hybridization을 사용하여 SARS-CoV-2 시각화

1. 커버슬립에서 배양된 Vero 세포의 SARS-CoV-2 RNA-FISH

1일차

1. 세포를 고정하고 투과화(Fixing and pereabilizing cells)
   1. RT에서 1시간 동안 3.7% w/v PFA 용액으로 감염된 세포를 수정합니다.
   2. 3.7% PFA 용액을 흡입하고 1x PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.
   3. PBST 용액으로 세포를 교반과 함께 RT에서 10분 동안 투과시킵니다.
   4. PBST를 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
2. 탐지
   1. 1x PBS 용액을 흡입하고 RT에서 2x SSC로 세포를 두 번 세척합니다.
   2. 2x SSC 용액을 흡입하고 최소 300μL의 프로브 혼성화 완충액을 추가하여 샘플을 사전 하이브리드화합니다. 세포가 들어있는 웰을 덮고 37 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
   3. 프로브 혼성화 완충액에 1.2 pmol의 프로브 혼합물을 첨가하여 프로브 용액을 준비합니다.
      1. 1.2μL의 1μM 프로브 스톡을 사용하여 300μL의 작업 스톡을 준비합니다.
   4. 사전 혼성화 용액을 제거하고 커버슬립을 가습된 챔버로 옮깁니다.
      1. 30-50 μL의 프로브 용액을 파라필름에 피펫팅하여 개별 액적을 형성합니다.
   5. 37 ° C에서 밤새 (12-18 시간) 샘플을 배양하십시오.

2일차

1. 커버슬립을 다시 12웰 플레이트로 옮기고 37°C에서 400μL의 프로브 세척 버퍼로 4 x 5분 동안 세척하여 과도한 프로브 용액을 제거합니다.
   메모: 배양을 위해 파라필름과 커버슬립 아래에 30-50μl의 분취량을 배치하는 대신 300μL의 프로브 용액을 12웰 플레이트의 커버슬립에 직접 첨가합니다. 이 절차는 더 간단하지만 상당한 양의 시약이 필요합니다. 사용하기 전에 프로브 세척 버퍼를 37°C로 가열하십시오. 필요한 완충액의 양을 계산하고 15mL 코니컬 원심분리 튜브로 옮깁니다.
2. RT에서 5x SSCT로 2 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
3. 5x SSCT 용액을 1x PBS로 교체하고 증폭될 때까지 샘플을 4°C에서 보관합니다.

3. 증폭

1. 웰에서 1x PBS 용액을 제거하고 각 웰에 최소 300μL의 증폭 완충액을 추가합니다. RT에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
2. 각 HCR 헤어핀(h1 및 h2)을 별도의 튜브에서 원하는 부피로 스냅 냉각하여 준비합니다.
   1. 300μL의 증폭 용액을 준비하려면 각 헤어핀을 18pmol을 사용합니다(예: 300μL의 경우 3μM 스톡 헤어핀 용액 6μL 사용).
   2. 머리핀 용액을 튜브로 옮깁니다.
   3. 95 °C에서 90 초 동안 배양합니다.
   4. 어둠 속에서 30분 동안 RT로 식히십시오.
3. 스냅 냉각된 "H1" 및 "H2" 헤어핀을 증폭 버퍼에 추가하여 헤어핀 혼합물을 준비합니다.
4. 30-50 μL의 헤어핀 혼합물을 파라필름에 떨어뜨립니다.
5. RT에서 어둠 속에서 밤새도록 (12-18 시간) 샘플을 배양하십시오.

3일차

1. 커버슬립을 다시 12웰 플레이트로 옮기고 교반과 함께 RT에서 5x SSCT로 5 x 5분 동안 세척하여 과도한 헤어핀을 제거합니다.
2. 5x SSCT 버퍼를 흡입하고 1x PBS.
   로 교체합니다. 메모: 필요한 경우 표준 면역형광 분석에서 RNA-FISH 샘플을 사용한 다음 핵을 염색합니다(섹션 1.4 참조).

4. 핵 염색 및 슬라이드 장착

1. 1x PBS 용액을 흡입하고 1x PBS 용액에서 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, 0.2μg/mL)으로 교체합니다.
2. 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
3. DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
4. 장착 매체 각각에 10μL씩 두 방울을 떨어뜨리고, 두 개의 커버슬립을 단일 슬라이드에 놓을 수 있도록 방울이 충분히 분리되었는지 확인합니다.
5. 깨끗한 수건에 커버슬립을 두드려 여분의 액체를 제거한 다음 셀이 아래를 향하도록 하여 퇴색 방지 장착 매체에 넣습니다.
6. 장착된 샘플을 어두운 곳의 건조하고 평평한 표면에 놓고 경화시킵니다.
7. 경화 후 VALAP 실런트 또는 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉하여 샘플이 마르지 않도록 합니다.

2. HAE 배양에서의 SARS-CoV-2 RNA-FISH

1일차

1. HAE 문화의 수정 및 침투
   1. 배지를 흡인하고 RT에서 1시간 동안 3.7% PFA 용액을 사용하여 감염된 세포를 고정합니다.
   2. 3.7% PFA 용액을 흡입하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
      1. Transwell 인서트 아래에서 3.7% PFA 용액을 1x PBS로 교체합니다.
   3. PBS를 버리고 s를 탈수합니다.amp-20°C로 예냉각된 100% MeOH로 5 x 20분 세척을 사용하여 les를 만듭니다.
   4. 두 번째 세척 후 Transwell 인서트 아래의 투과화를 위해 버퍼를 신선하고 냉각된 MeOH로 교체합니다. -20 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

2일차

1. 수분 보충
   얼음 위에서 등급이 매겨진 일련의 MeOH/PBST 용액(각각 5분간)을 통해 샘플을 재수화합니다: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS 및 100% PBST(2회).
   1. 50% SSCT/50% PBST를 사용하여 얼음에서 5분 동안 세포를 세척합니다.
   2. 5x SSCT로 얼음에서 5분 동안 세포를 세척합니다.
   3. 5x SSCT 버퍼를 1x PBS로 교체합니다.
2. 탐지
   1. 100 μL의 프로브 혼성화 완충액을 사용하여 얼음 위에서 5분 동안 세포(Transwell 인서트 내부)를 배양합니다. 다음으로, 플레이트를 37°C(사전 혼성화)에서 30분 동안 인큐베이터로 옮깁니다.
      메모: 프로브 혼성화 버퍼는 사용하기 전에 37°C로 예열해야 합니다. 필요한 부피를 계산하십시오: 단일 Transwell 인서트에 100 μL가 필요합니다.
   2. 프로브 용액을 준비합니다. 1mL의 프로브 용액에는 4pmol의 프로브가 필요하므로 1mL의 프로브 혼성화 버퍼에 1μL 프로브 스톡 용액 4μL를 추가하고 잘 혼합합니다.
      메모: RNA 검출의 경우 Transwell 인서트당 100μL의 프로브 용액을 사용합니다. 사전 하이브리드화 단계가 끝날 때까지 프로브 용액을 얼음 위에 두십시오.
   3. prehybridization 용액을 제거하고 프로브 용액을 추가합니다.
   4. 세포를 37 ° C에서 밤새 (12-18 시간) 배양하십시오.

3일차

1. 37°C에서 100μL의 프로브 세척 버퍼로 4 x 15분 동안 세척하여 여분의 프로브를 제거합니다.
2. RT에서 5x SSCT로 2 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
3. 5x SSCT를 1x PBS로 교체하고 증폭될 때까지 샘플을 4°C에서 보관합니다.

1. 증폭

1. RT에서 30분 동안 증폭 버퍼로 샘플을 배양하여 샘플을 사전 증폭합니다.
2. 별도의 튜브에서 원하는 부피를 스냅 냉각하여 각 헤어핀을 준비합니다.
   1. 500μL의 증폭 용액을 준비하려면 각 헤어핀을 30pmol을 사용합니다(예: 500μL의 경우 3μM 스톡 헤어핀 용액 10μL 사용).
   2. 헤어핀 용액을 튜브로 옮깁니다.
   3. 95 °C에서 90 초 동안 배양합니다.
   4. 어둠 속에서 30분 동안 RT로 식히십시오.
3. RT에서 500μL의 증폭 버퍼에 모든 스냅 냉각 헤어핀을 추가하여 헤어핀 용액을 준비합니다.
4. 사전 제거amplification 용액을 추가하고 완전한 헤어핀 용액을 추가합니다.
5. 어둠 속에서 RT에서 하룻밤(12-18시간) 샘플을 배양합니다.
6. 다음과 같이 RT에서 5x SSCT로 세척하여 여분의 헤어핀을 제거합니다: 2 x 5분, 2 x 15분, 1 x 5분.
7. 5x SSCT 용액을 1x PBS로 교체하고 4°C에서 2-3일 이상 보관하지 않거나 바로 핵 염색을 진행합니다.
   메모: 필요한 경우 표준 면역형광 분석에서 RNA-FISH 샘플을 사용한 다음 핵 염색을 수행합니다(섹션 3 참조).

5. 핵 염색 및 슬라이드 장착

1. 1x PBS 용액을 흡입하고 1x PBS의 DAPI 용액(0.2μg/mL)으로 교체합니다.
2. 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
3. DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
4. Transwell 인서트의 컷아웃 멤브레인을 셀이 위를 향하도록 하여 10μL의 페이드 방지 마운팅 미디어(medium of 10 μL)에 놓고 멤브레인에 추가 마운팅 미디어(5 μL)를 추가합니다.
5. 커버 슬립으로 멤브레인을 덮으십시오.
6. 장착된 샘플을 어두운 곳에서 건조하고 평평한 표면에서 경화시킵니다.
7. 경화 후 VALAP 실런트 또는 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉하여 샘플이 마르지 않도록 합니다.

3. Vero 세포 및 HAE 배양의 면역 형광 분석

참고: 세포주의 경우 3일째, HAE 배양의 경우 4일째에 면역형광 분석을 수행합니다. 모델마다 다른 접근 방식을 사용합니다. 모든 차이점이 명확하게 표시됩니다.

1. 웰에서 1x PBS 용액을 흡입합니다.
2. 37°C에서 30분 동안 PBST 용액에 1% w/v 소 혈청 알부민으로 배양하여 샘플을 차단합니다.
3. 차단 용액에 적절한 희석액을 준비하여 1차 항체를 준비하고 배양합니다.
   1. 커버슬립에 있는 Vero 셀의 경우:
      1. 항체 용액 방울(30-50 μL)을 습도 챔버의 파라필름에 떨어뜨립니다.
      2. 세포가 아래를 향하도록 하여 항체 방울에 커버슬립을 놓습니다.
   2. HAE의 경우 인서트의 차단제를 항체 용액(100μL)으로 교체하고 가습된 챔버에서 샘플을 배양합니다.
      참고: 1차 항체로 각 배양의 시간과 온도를 조정합니다. 일반적인 매개변수는 RT에서 2시간 또는 4°C에서 밤새도록 사용할 수 있습니다.
4. PBST로 3 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
   1. 커버슬립에 있는 세포의 경우 12웰 플레이트로 옮기고 PBST 용액을 추가합니다.
   2. HAE 배양의 경우 항체 용액을 PBST 용액으로 교체합니다.
5. 컨포칼 현미경에 사용할 수 있는 광원과 필터를 확인합니다.
6. 숙주 종에 따라 2차 항체를 선택합니다. 형광단 매개변수(사용 가능한 광원에 따른 여기 및 방출 파장, 스펙트럼 폭 및 여기 효율)를 선택합니다.
   메모: 스펙트럼 매개변수는 온라인 도구를 사용하여 모델링할 수 있습니다(재료 표 참조).
7. 적절한 2차 항체 용액을 차단 용액으로 희석하여 준비합니다.
8. 2 차 항체 (6.3에서와 같이)로 배양하지만 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
9. 3.4단계와 같이 샘플을 세척합니다.
10. 핵 염색 및 슬라이드 장착
    1. 커버슬립에 있는 세포의 경우
       1. PBST를 흡인하고 1x PBS 용액에서 DAPI(0.2μg/mL)로 교체합니다.
       2. 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
       3. DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
       4. 셀이 아래를 향하도록 하여 10μL의 장착 매체 방울에 커버 슬립을 놓습니다.
       5. 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하십시오.
    2. HAE 배양의 경우
       1. 1x PBST를 흡입하고 1x PBS 용액에서 DAPI(0.2μg/mL)로 교체합니다.
       2. 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
       3. DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
       4. 세포가 위를 향하도록 하여 10μL의 마운팅 배지 방울에 컷아웃 멤브레인을 놓고 멤브레인에 추가(5μL)의 마운팅 배지를 추가합니다.
       5. 커버 슬립으로 멤브레인을 덮으십시오.
       6. 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하십시오.

4. 컨포칼 현미경 검사

1. 사용된 형광단을 지정하여 트랙을 정의합니다.
2. 스캔 모드와 속도를 선택합니다.
3. 각 형광단을 각각의 음성 대조군과 비교하여 레이저 출력, 이득 및 오프셋 값을 조정합니다: 바이러스의 경우 모의 감염 세포, 세포 단백질의 경우 적절한 숙주의 동형 제어 항체로 염색된 샘플
.
4. 3D 이미지를 획득하려면 z-스택 모드를 활성화하고 상하 및 하한을 설정합니다. 단계 크기/번호를 설정합니다.
   메모: 코로나바이러스 영상에 대한 자세한 내용은.