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방법 논문

인간 혈청에서 중화 항체 역가를 측정하기 위한 미세중화 분석

2.1K 조회수

⸱

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

출처: Gross, F. L. et al., MDCK-SIAT1 세포를 사용한 미세중화 분석으로 인간 혈청에서 A(H3N2) 바이러스에 대한 인플루엔자 중화 항체 반응 측정.J. Vis. 특급(2017년)

이 비디오는 인간 혈청에서 α2,6 연결된 시알산을 과발현하는 Madin-Darby Canine Kidney cell을 사용하여 중화 항체를 측정하는 Microneutralization 분석을 보여줍니다. 이 분석법은 종종 인플루엔자 인간 혈청학에 사용됩니다

프로토콜

모든 인플루엔자 바이러스는 미생물 및 생물 의학 실험실의 생물 안전성 (BMBL)에 정의 된 적절한 생물 안전 수준 요구 사항 (BSL-2 이상)에 따라 처리해야합니다.

1. 시약 및 출발 물질의 준비

  1. Madine Darby Canine Kidney-α2,6-sial transferase (MDCK-SIAT1) 세포 및 무균 세포 배양 배지를 준비합니다.
    1. 고포도당, 10% v/v 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨, 1mg/mL G418 황산염(예: 게네티신) 및 100U/ml 페니실린과 100μg/mL 스트렙토마이신(선택 사항)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 500mL를 사용하여 MDCK-SIAT1 세포 배양 배지를 준비합니다. 0.2μM 공극 크기의 멤브레인을 통해 여과하여 멸균합니다. MDCK-SIAT1 세포에서 플라스미드 안정성을 보장하기 위해 G418 황산염이 첨가됩니다.
    2. MDCK-SIAT1 세포주를 준비합니다. 30mL의 멸균 세포 배양 배지를 함유한 162cm2-조직 배양 플라스크에 2 - 2.5 x 106 MDCK-SIAT1 세포가 있는 시드 플라스크를 넣고 37°C에서 5% CO2에서 2일 동안 배양합니다. 이는 조직 배양 감염선량(TCID) 측정 및 MN 분석에 사용됩니다.
      메모: MDCK-SIAT1 세포는 독일 마르부르크의 M. Matrosovich 박사에 의해 친절하게 제공되었습니다. 이 세포주는 상업적으로도 얻을 수 있습니다(재료 표 참조).
  2. DMEM 고포도당 500mL, 0.3% 소 혈청 알부민(BSA) 분획 V, 페니실린 100U/mL, 스트렙토마이신 100μg/mL 및 20mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES)을 사용하여 멸균 바이러스 증식 배지를 준비합니다. 0.2μM 공극 크기의 멤브레인을 통해 여과하여 멸균합니다.
  3. pH 7.2에서 0.01M PBS를 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.75%(v/v) 기니피그 적혈구(gpRBC)를 준비합니다.
  4. DMEM 고포도당, 1% 소 알부민 분획 V(BSA), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 20 mM HEPES를 사용하여 멸균 바이러스 희석제를 준비합니다. 0.2μm 공극 크기의 멤브레인으로 여과하여 멸균하고 각 분석에 대해 새로 준비합니다.
  5. PBS(0.01M PBS, pH 7.2)에서 80% 저온 아세톤으로 콜드 셀 고정제를 준비합니다.
  6. PBS(0.01M PBS pH 7.2) 및 0.3%(v/v) tween-20을 사용하여 세척 버퍼를 준비합니다.
  7. PBS(0.01M PBS, pH 7.2), 0.3%(v/v) tween-20 및 5% 무지방 분유를 사용하여 항체 희석제를 준비합니다.
  8. 항인플루엔자 A NP 마우스 단클론 항체 클론 A1 및 A3 풀을 1차 항체로 사용합니다. 항체 희석제를 적정에 의해 결정된 최적의 농도로 희석합니다.
  9. 2차 항체로 HRP(Horse Radish peroxidase)에 접합된 염소 항-마우스 IgG를 사용합니다. 항체 희석제를 적정에 의해 결정된 최적의 농도로 희석합니다.
  10. pH 5에서 0.05M 인산염 시트레이트 완충액에 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD)를 사용하여 과산화효소 기질을 준비합니다. 1 캡슐/100 mL 탈이온화된 H2O를 용해하여 0.05 M 인산염 시트레이트 완충액을 준비합니다. 사용 직전에 1 OPD 정제(10 mg)/20 mL의 인산염 시트레이트 완충액을 용해시킵니다.
  11. OPD 정지 용액으로 0.5M의 황산을 사용합니다. 화학 후드에 28mL의 18M 황산 스톡을 972mL의 탈이온화된 H2O에 추가합니다.
  12. 인간과 동물 혈청의 치료
    1. MN 분석에 사용된 인간 혈청을 분석 전 30분 동안 56°C의 수조에서 가열합니다. 즉시 사용하거나 필요한 경우 해동된 혈청을 4°C에서 24시간 이상 보관하지 마십시오. 더 긴 보관 기간이 필요한 경우 -20 °C 이하에서 냉동 보관하십시오.
    2. MN 분석에 사용된 동물 혈청을 수용체 파괴 효소(RDE)로 처리하고 분석 전에 불활성화를 다음과 같이 가열합니다.
      1. 37°C 수조에서 혈청을 해동한 다음 얼음 위에 놓습니다. 동물 혈청 샘플 1권과 RDE 3권을 혼합합니다. 37 ° C에서 18 - 20 시간 동안 배양하십시오.
      2. RDE 처리된 혈청을 56°C에서 30분 동안 가열하고 각 샘플에 PBS 6부피, pH 7.2를 추가하여 1:10의 최종 사전 희석을 합니다. 필요한 경우 해동 된 혈청을 4 ° C에서 24 시간 이상 보관하지 마십시오. 더 긴 보관 기간이 필요한 경우 -20 °C 이하에서 냉동 보관하십시오.
        메모: 동물 혈청은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 또는 HA에 결합하여 인플루엔자 특이적 항HA 항체의 결합을 억제할 수 있는 다양한 시알산 글리칸을 포함할 수 있습니다. 따라서 혈청 샘플에서 이러한 비특이적 바이러스 HA 결합제를 제거하기 위해 MN 분석 전에 모든 동물 혈청을 RDE 처리해야 합니다.

2. MDCK-SIAT1 세포 배양 통과

참고: 모든 세포 배양은 오염을 방지하기 위해 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

  1. 세포 단층에서 세포 배양 배지를 162cm2 플라스크로 디캔팅합니다. 단층을 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)으로 헹궈 세포를 트립신화합니다. 세포 단층을 덮기 위해 5mL 트립신-EDTA를 추가합니다. 단층이 분리될 때까지 37°C, 5% 이산화탄소, CO2에서 배양합니다(5-10분). 트립신화된 세포가 포함된 각 플라스크에 MDCK-SIAT1 세포 배양 배지 15mL를 추가하고 세포를 위아래로 피펫팅하여 분리합니다.
  2. 혈구계와 트리판 블루를 사용하여 세포 수와 생존력을 확인합니다. 2-2.5 x 106 세포/플라스크가 있는 30mL의 세포 배양 배지를 포함하는 새로운 162cm2 조직 배양 플라스크에 세포를 파종하고 TCID 및 MN 분석에 사용하기 위해 2일 동안 5% CO2로 37°C에서 배양합니다. 4 - 5 x 106 cells/flask에서 세포를 종종하고 바이러스 전파에 사용하기 위해 37°C에서 5% CO2로 2일 동안 배양합니다.
    메모: 파종 밀도는 더 짧거나 더 긴 배양 기간을 원하는 경우 조정할 수 있습니다. 바이러스 증식을 위해서는 세포가 100% 이상의 포화도에 도달해야 합니다. 조직 배양 감염 선량(TCID) 및 MN 분석의 경우 세포의 밀도가 75 - 95%여야 합니다(그림 1).

3. MDCK-SIAT1 세포에서 A(H3N2) 바이러스 증식

참고: A(H3N2) 바이러스는 표준 프로토콜에 따라 10-11일 된 배아 암탉의 난자 또는 MDCK-SIAT1 세포 배양에서 전파될 수 있습니다. MDCK-SIAT1 세포는 바이러스 접종을 위해 100% 이상의 포화도에 도달해야 합니다. 바이러스 종자 스톡은 여러 희석액의 접종으로 접종할 수 있습니다. 수확 HA와 감염성이 가장 좋은 접종물 희석액은 추가 MN 분석에 사용할 수 있습니다.

  1. 세포 단층(>100% confluency)에서 세포 배양 배지를 162cm2 플라스크에서 제거합니다. 15mL의 멸균 0.01M PBS, pH 7.2 및 디캔트로 단층을 두 번 세척합니다.
  2. 1 플라스크를 대조군으로 표시하고 20mL의 바이러스 증식 배지를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2로 플라스크를 배양합니다. 이 플라스크를 손대지 않은 상태로 두고 바이러스 전파 1일차 이후 비교용으로 사용하십시오.
  3. 10mL의 멸균 바이러스 증식 매체를 플라스크에 추가하고 모든 플라스크를 37°C, 5% CO2에서 배양합니다. 인플루엔자 바이러스 스톡이 담긴 바이알을 실온에서 해동한 다음 얼음 위에 올려 놓습니다. 바이러스 전파 매체를 사용하여 표적 희석액으로 희석합니다.
    메모: 바이러스 스톡의 HA 역가를 기반으로 목표 희석을 조정할 수 있습니다. 1:1000 희석된 접종물을 준비하려면 9.9mL의 멸균 바이러스 증식 배지에 100μL의 바이러스를 추가합니다. 부드럽게 반전시키고, 1:100 희석 1mL를 멸균 바이러스 증식 매체 9mL에 제거한 후 부드럽게 반전시켜 1:1000 희석된 접종물을 만듭니다. 얼음 위에 놓습니다.
  4. 인큐베이터에서 제어 플라스크를 제외한 모든 플라스크를 제거합니다. MDCK-SIAT1 세포의 플라스크에서 바이러스 증식 매체를 제거하고 각 플라스크에 희석된 바이러스 10mL를 접종합니다. 플라스크를 37 ° C, 5 % CO2에서 1 시간 동안 배양하고 15 분마다 플라스크를 회전시킵니다.
  5. 플라스크에서 접종물 5mL를 제거하고 1μg/mL 토실 페닐알라닐 클로로메틸 케톤 처리 트립신(TPCK-트립신)을 포함하는 15mL 바이러스 전파 매체로 교체합니다. 플라스크를 37 ° C, 5 % CO2에서 16-18 시간 동안 배양합니다.
  6. 하룻밤 배양 후 100X 현미경 배율로 플라스크를 관찰하고 세포에 대한 세포 요법 효과(CPE)를 확인합니다. 플라스크에서 15-17 mL의 바이러스 상층액을 제거하고, 2 μg/mL TPCK-트립신을 함유한 15 - 17 mL의 새로 준비된 바이러스 증식 배지로 교체합니다.
  7. 플라스크를 37 ° C, 5 % CO2 에서 배양하십시오. 단층의 CPE를 모니터링하고(세포 제어 플라스크와 비교하여) 수확할 때까지 0.75% gpRBC로 주기적으로(4시간마다) HA를 확인합니다.
    1. HA 96웰 마이크로타이터 플레이트를 설정합니다. 0.01M PBS 50μL, pH 7.2를 웰 A2 - A12 및 B2 - B12(중복)에 추가하고 웰 H1 - H12에 대조군을 추가합니다.
    2. A1과 A2에 바이러스 상등액 100 μL를 첨가하고 A1과 B1에서 A12와 B12까지 2배 연속 희석을 수행합니다. A12와 B12에서 혼합한 후 50μL를 버립니다. 50μL의 0.75% gpRBC를 A, B, H열에 추가합니다.
    3. 플레이트를 두드리고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
      1. 96웰 마이크로타이터 플레이트를 45° - 60° 각도로 기울여 바이러스 상층액의 HA를 측정합니다.
      2. 혈구응집(hemagglutination)을 위한 판독 플레이트; 완전한 혈구응집(hemagglutination)을 달성하는 바이러스의 가장 높은 희석은 특정 바이러스에 대한 HA 적정 종말점으로 간주됩니다. 바이러스의 HA 역가로 완전한 혈구응집과 함께 가장 높은 바이러스 희석의 역수를 기록합니다.
        메모: H열(대조군)에 침전된 적혈구는 "달리기"를 시작하고 중력으로 인해 작은 눈물방울 모양을 형성해야 합니다. 대조군의 적혈구가 작동을 마칠 때까지 기다린 다음 바이러스 적정 웰의 적혈구 버튼을 읽습니다. RBC 버튼을 나타내고 "실행"하는 것은 혈응집화를 달성하지 않습니다. 혈응집을 완전히 억제하는 바이러스의 가장 높은 희석도를 바이러스의 종말점 HA 역가로 찾습니다.
  8. 바이러스 배양 안정기 또는 바이러스 배양의 HA가 타겟 HA(예: >16 HA 단위)에 도달했을 때 세포 단층이 유의한 CPE를 나타내기 시작하기 전에 바이러스를 수확합니다.
    1. 바이러스 배양 상층액을 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다. 바이러스 수확물을 포함하는 정화된 상등액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 바이러스 수확물을 포함하는 상등액을 일회용 멸균 극저온 바이알에 분취하고 즉시 -70°C 이하에서 동결합니다.
      메모: MN 분석에 사용되는 바이러스 스톡은 전염성이 높고 결함 있는 입자가 최소화되어야 합니다. MN 분석에서 100 TCID50/50 μL를 달성하기 위한 바이러스 스톡의 최소 희석은 1:100입니다.
      메모: MN 분석에 사용된 바이러스 스톡은 해동 및 재동결해서는 안 됩니다.

4. 바이러스의 TCID 결정

  1. 1일차: 바이러스 적정
    1. 바이러스가 든 바이알을 실온에서 해동하고 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오.
    2. 두 가지 다른 시작 희석액(10-2 및 10-3)에서 바이러스를 테스트합니다. 100μL의 바이러스를 9.9mL의 바이러스 희석제에 첨가하여 10-2 희석합니다. 바이러스 희석제 9.0mL에 10-2 희석 1mL를 첨가하여 10-3 희석합니다.
    3. 두 개의 마이크로타이터 플레이트(10-2 희석의 경우 플레이트 1, 10-3 희석의 경우 플레이트 2)를 사용하여 96웰 마이크로타이터 플레이트의 컬럼 1을 제외한 모든 웰에 100μL의 바이러스 희석액을 추가합니다.
    4. 1/2log10 희석(10-2, 10-2.5, 10-3 등)을 수행합니다. 1열의 모든 웰에 146μL의 바이러스 시작 희석을 추가하고 1열에서 11열까지 46μL를 연속으로 전달합니다(그림 2). 웰 사이의 피펫 팁을 교체합니다. 컬럼 11을 혼합한 후 46μL 희석액이 함유된 팁을 폐기합니다.
    5. 열 12를 세포 제어(CC)로 사용하십시오. 여기에는 바이러스 희석제만 포함되어 있습니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 1 시간 동안 배양하십시오.
  2. 1일차: MDCK-SIAT1 세포 <br /> 준비 메모: MDCK-SIAT1 세포 단층은 TCID 및 MN 분석에서 75 - 95% 농도에 도달해야 합니다. 95% 포화도에서 162cm2 플라스크 1개는 ~ 4 - 5 마이크로타이터 플레이트를 시딩하기에 충분한 세포를 생성해야 합니다.
    1. 75 - 95% confluent monolayer를 20 mL PBS로 세척하여 배양 배지에서 FBS를 제거합니다. 다음과 같이 세포를 트립신화합니다.
      1. 멸균 PBS로 단층을 헹구고 7mL 트립신-EDTA를 첨가하여 세포 단층을 덮습니다. 플라스크를 평평하게 놓고 단층이 분리될 때까지 37°C, 5% CO2에서 배양합니다(약 5 - 10분). 트립신화된 세포를 포함하는 각 플라스크에 바이러스 희석제 7mL를 추가합니다.
    2. 바이러스 희석제로 세포를 세척하여 FBS를 제거합니다.
      1. 세포를 분리하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 세포를 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브에 바이러스 희석제를 채웁니다.
      2. 485 x g에서 5분 동안 원심분리기 바이러스 희석액을 디캔팅하고 새 50mL 바이러스 희석제로 교체한 다음 485 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 바이러스 희석액을 디캔팅하고 새 바이러스 희석제(10mL/플라스크)로 교체하여 펠릿을 재현탁합니다.
    3. 혈구계와 트리판 블루를 사용하여 세포 수와 생존력을 확인합니다. 바이러스 희석액으로 세포 농도를 1.5 x 105 cells/mL로 조정합니다.
    4. 희석된 MDCK-SIAT1 세포 100μL를 마이크로타이터 플레이트의 각 웰(1.5 x 10,4개 셀/웰)에 추가하고 플레이트를 덮습니다. 37 ° C, 5 % CO2에서 18-20 시간 동안 배양합니다.
  3. 2일차: 엘리사
    1. 세포의 정착
      1. 마이크로타이터 플레이트에서 매체를 제거합니다. 200μL의 PBS로 각 웰을 세척합니다. 각 웰에 300μL의 차가운 80% 아세톤을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 정착액을 제거하고 플레이트를 자연 건조시킵니다.
    2. 엘리사
      1. 1차 항체 추가
        메모: 인플루엔자 A NP 단일클론 항체는 ELISA의 1차 항체로 과도하게 사용해야 합니다. MN에서 항체 적정을 수행하여 각 1차 항체 로트에 대한 최적의 항체 희석을 결정합니다. 초과되고 최상의 신호 대 백그라운드 비율을 가진 1차 항체 농도를 선택합니다.
        1. 항인플루엔자 A NP 단클론 항체(1차 항체)를 항체 희석제의 목표 농도로 희석합니다(예: 1:1000의 목표 희석을 위해 30mL의 항체 희석제에 1차 항체 30μL 추가).
        2. 300μL의 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척합니다. 각 웰에 100μL 희석된 1차 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
      2. 2차 항체 추가
        참고: 무 과산화효소(HRP)에 접합된 염소 항-마우스 면역글로불린, IgG는 ELISA의 2차 항체로 과도하게 사용해야 합니다. 항체 적정을 수행하여 각 2차 항체 로트에 대한 최적의 항체 희석을 결정합니다. 2차 항체 농도가 초과되고 신호 대 배경 비율이 가장 좋은 것을 선택합니다.
        1. HRP 항체(2차 항체)에 접합된 염소 항-마우스 IgG를 항체 희석제의 목표 농도로 희석합니다(예: 표적 1:4000 희석을 위해 30mL의 항체 희석제에 7.5μL의 2차 항체를 추가).
        2. 300μL 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척합니다. 각 웰에 100μL 희석된 2차 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
      3. 기판 추가 및 플레이트 판독
        1. 300μL 세척 버퍼로 플레이트를 5회 세척하고 보풀이 없는 천을 두드립니다.
        2. 각 웰에 새로 준비된 기질 100μL를 추가하고 발색이 포화되고 세포 제어 웰의 광학 밀도(OD)가 <0.2가 될 때까지 실온에서 배양합니다.
        3. 모든 웰에 100μL의 정지 용액을 추가합니다. 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 490nm에서 웰의 OD를 판독합니다.
  4. TCID 50 계산
    1. 셀 컨트롤의 중앙값 OD490을 계산합니다(열 12).
    2. CC 웰의 중앙값 OD490의 두 배 이상인 OD490 웰을 가진 모든 테스트는 "양성"으로 간주되며, 그렇지 않으면 "음성"으로 간주됩니다.
    3. Reed-Muench 방법을 사용하여 바이러스의 TCID50을 계산합니다.
      1. 각 희석에서 양성 및 음수 수를 결정합니다.
      2. 표 1과 같이 "누적 긍정", "누적 음수", "비율" 및 "% 긍정"을 계산합니다.
      3. 다음을 사용하여 >50% 양성을 나타내는 희석과 <50% 양성을 나타내는 희석 사이의 "비례 거리"를 계산합니다
        figure-protocol-1
        메모: 1/2 log 희석에 대한 수정 계수는 0.5입니다. 예를 들어, 표 1에서: (80 − 50)/(80 − 20) x 0.5 = 0.25
      4. 희석액에 비례 거리를 더하여 바이러스 TCID50> 계산하여 50% 양성을 보여줍니다.
        메모: 예를 들어, 표 2에서 TCID50은 10-5+(-0.25) = 10-5.25입니다. 참고: 이것은 100 μL(또는 10-5.25/100 μL)당 바이러스의 TCID50입니다.
    4. 바이러스 희석을 계산합니다. MN 분석의 경우 바이러스를 200 TCID50/100 μL(웰당 100 TCID50/50 μL에 해당)로 희석합니다.
      메모: 표 1의 예에서 1 TCID50은 100 μL에서 10-5.25이고 200 TCID50/100 μL에 도달하기 위한 희석은 계산에 따라 1:891입니다: 200 x 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102.95 = 1/891

5. MDCK-SIAT1 세포를 사용한 MN 분석

  1. 1일차: 혈청 준비 및 플레이트 레이아웃 테스트 및 제어
    1. 37°C 수조에서 혈청을 해동하고 해동 후 즉시 제거하십시오. 분취량: 검사해야 하는 혈청의 양; 단일 항아리에서 하나의 바이러스로 테스트하려면 최소 10μL의 원래 혈청이 필요합니다. 가능한 경우 중복 혈청을 테스트하십시오.
    2. 1.12.1단계와 같이 56°C 수조에서 30분 동안 인간 혈청을 가열하여 비활성화합니다. 열 비활성화 후 얼음 위에 혈청을 놓고 혈청에 바이러스 희석액을 첨가하여 1:10 사전 희석을 달성합니다.
    3. RDE는 동물 혈청을 1.12.2.
      에 따라 대조군에 사용하기 위해 1:10으로 미리 희석하고 미리 희석합니다. 메모: 해동 및 처리 된 인간 및 동물 혈청은 4 ° C에서 24 시간 이상 보관할 수 없습니다. 혈청은 분석 전에 더 긴 보관 기간이 필요한 경우 -20°C 이하에서 냉동 보관해야 합니다.
    4. 하나의 바이러스로 테스트하려면 100μL 1:10 희석 혈청을 A1 - A10 열에 추가합니다(그림 3). 11열과 12열을 제외한 B-H행에 50μL의 바이러스 희석제를 추가합니다(그림 3). A행에서 H행까지 2배 직렬 희석을 수행하고 H행에서 마지막 50μL를 버립니다(그림 3).
      메모: 여러 바이러스를 검사할 때 혈청은 역가관에서 희석될 수 있습니다. 혈청 역가를 측정하기 위한 혈청의 희석은 웰 A에서 1:10, 웰 B 1:20, 웰 C 1:40, 웰 D 1:80, 웰 E 1:160, 웰 F 1:320, 웰 G 1:640, 웰 H 1:1,280입니다(그림 3).
    5. 바이러스 제어를 위해 50μL의 바이러스 희석제를 웰 A12, B12, C12 및 D12(혈청 없음)에 추가합니다. 세포 대조군의 경우 100μL의 바이러스 희석제를 웰 E12, F12, G12 및 H12(바이러스 없음, 혈청 없음)에 추가합니다.
    6. 대조군 혈청(예: 페럿 혈청 대조군)의 경우, 웰 A 컬럼 11에 100μL의 희석된 대조군 혈청을 추가하고 웰 B11 - H11에 50μL의 바이러스 희석액을 추가합니다. 직렬은 아래로 희석합니다.
    7. 플레이트를 덮고 바이러스가 추가될 준비가 될 때까지 37°C, 5% CO2에서 배양합니다.
  2. 1일차: 바이러스 추가
    1. 바이러스 희석액을 사용하여 바이러스를 100 TCID50/50 μL로 희석합니다.
    2. 백 적정(BT) 플레이트의 컬럼 11과 모든 플레이트의 세포 제어 웰 E12, F12, G12 및 H12를 제외한 모든 웰에 50μL 희석된 바이러스를 추가합니다(그림 3). 11열에 대조군 혈청이 있는 플레이트의 경우 11열에 바이러스를 추가합니다.
    3. 역 적정(BT)
      1. 한 세트의 중복 플레이트(예: 플레이트 1A 및 1B)의 열 11에 BT를 포함합니다. 50μL의 바이러스 희석제를 컬럼 11의 모든 웰에 추가합니다. 100 TCID 50/50 μL의 바이러스50 μL를 첫 번째 웰(A11)에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
      2. 50μL를 혼합하고 연속적인 웰로 이동하여 2배 직렬 희석을 수행합니다. 바이러스 전달을 방지하기 위해 웰 사이의 피펫 팁을 교체하십시오. 웰 H11에서 50μL를 버립니다.
      3. 11컬럼에 50μL의 바이러스 희석액을 추가하여 최종 부피를 100μL로 만듭니다. 플레이트를 두드려 혼합합니다.
    4. 37 ° C, 5 % CO2에서 1 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
    5. 4.2단계 및 4.3단계(5.3 및 5.4에도 설명됨)에 설명된 대로 1일차에 MDCK-SIAT1 세포 추가를 수행하고 2일차에 ELISA를 수행합니다.
  3. 1일차: MDCK-SIAT1 세포 추가
    1. 4.2단계에서 설명한 대로 MDCK-SIAT1 셀을 준비합니다. 각 웰(1.5 x 10,4 cells/well)에 1.5 x 105 cells/mL의 100 μL MDCK-SIAT1 cell을 추가합니다. 플레이트를 37 ° C, 5 % CO2에서 18-20 시간 동안 배양합니다.
  4. 2일차: 엘리사
    1. 하룻밤 배양 후 둘째 날에는 4.3 단계에서 설명한대로 80 % 차가운 아세톤으로 세포를 고정합니다.
    2. 1차 항체 추가
      1. 300μL 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척합니다. anti-influenza A NP monoclonal antibody(1차 항체)를 항체 희석제의 적정에 의해 결정된 최적의 농도로 희석합니다(예: 1:1000의 목표 희석을 위해 30mL의 항체 희석제에 1차 항체 30μL 추가).
        참고: 웰당 100μL의 1차 항체가 필요합니다. 플레이트당 ~10mL가 필요합니다.
      2. 각 웰에 100μL 희석된 1차 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    3. 2차 항체 추가
      1. 300μL 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척합니다. HRP 항체(2차 항체)에 접합된 염소 항-마우스 IgG를 항체 희석제의 목표 농도로 희석합니다(예: 타겟 1:4000에 대한 항체 희석제 30mL에 2차 항체 7.5μL 추가).
        참고: 96웰당 100μL의 2차 항체가 필요합니다. 플레이트당 ~10mL가 필요합니다.
      2. 각 웰에 100μL 희석된 2차 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    4. 기판 추가 및 플레이트 판독
      1. 300μL 세척 버퍼로 플레이트를 5회 세척하고 보푸라기가 없는 천을 두드립니다.
      2. 새로 준비된 기질 100μL를 각 웰에 추가하고 바이러스 제어 웰이 OD490 = 0.8 - 3에 도달할 때까지 실온에서 배양하고 세포 제어는 낮은 백그라운드 OD490 <0.2에서 배양합니다.
      3. 정지 용액 100μL를 모든 웰에 추가합니다. 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 490nm에서 웰의 OD를 판독합니다.
  5. 데이터 분석
    메모: MN 계산은 각 플레이트에 대해 개별적으로 결정됩니다.
    1. 각 혈청 샘플의 중화 항체 역가를 측정합니다.
      1. 다음 방정식을 사용하여 각 플레이트에 대한 50% 바이러스 중화의 OD490 컷오프를 계산합니다.
        figure-protocol-2
        메모: 여기서 x = 중화 컷오프의 50%. OD490의 최대 희석량이 컷오프의 50% 미만(≥50% 억제)에 해당하는 상호 혈청 희석액은 해당 혈청 샘플에 대한 중화 항체 역가로 간주됩니다(그림 4).
    2. 세포 제어 웰의 OD490 <0.2와 바이러스 제어 웰의 OD490 = 0.8 - 3을 확인합니다.
    3. 바이러스 BT에 의한 각 분석(100x TCID50)에서 바이러스 감염성을 확인합니다. BT의 허용 범위는 50, 100 또는 200 TCID입니다. 4.4.2단계에서 정의한 것과 동일한 차단을 사용하는 경우 OD가 차단보다 높은 BT 컬럼에서 가장 높은 바이러스 희석은 웰 E11, F11 및 G11.
      이어야 합니다. 메모: 혈청 양성 대조군은 이전 테스트에서 얻은 값의 2배 이내의 역가를 제공해야 합니다. 음성 혈청 대조군의 OD490은 바이러스 대조군에서 관찰된 것과 유사해야 합니다.

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결과

figure-results-1
그림 1. MDCK-SIAT1 세포 배양.MDCK-SIAT1 세포. (A) 바이러스 접종을 위한 MDCK-SIAT1 융합 단층(>100% 융합도); (B) TCID50 및 MN 분석에 대한 75 - 95% 포화도를 가진 로그 단계의 MDCK-SIAT1 세포.

figure-results-2
그림 2. TCID 플레이트 레이아웃.바이러스 감염성은 TCID50에 의해 결정됩니다. 바이러스 스톡...

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트립신-EDTA생명과학1748048
RDE II "성검"덴카 세이켄370013
트윈 20시그마-알드리치P1379-500ml
항-NP 마우스 단클론 AbMillipore 수영장MAB 8257 MAB 8258
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플레이트 리더분자 장치스펙트로맥스 384 플러스
세포 배양 플라스크 162 cm2/벤트 캡코닝/VWR3151
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