면역 유도 시 애기장대 잎 디스크에서 산화 버스트를 감지하기 위한 분석

초록

출처: Bredow, M., et al. Arabidopsis thaliana의 패턴 트리거 산화 버스트 및 묘목 성장 억제 분석. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 면역 유도 시 애기장대 잎의 산화 폭발을 측정하는 분석을 보여줍니다. 식물 잎에서 잘라낸 잎 디스크는 미생물 관련 분자 패턴 또는 MAMP로 기능하는 박테리아 펩타이드와 함께 배양됩니다. MAMP가 검출되면 식물 세포는 화학발광 분석을 사용하여 검출되는 세포 외 ROS의 생성을 유도합니다.

프로토콜

1. 면역 유도 후 애기장대 잎 디스크에서 ROS 파열 감지

1. 식물 성장 및 유지 관리.
   1. 발아를 동기화하려면 멸균 0.1% 한천[w/v] 1mL에 약 50개의 종자를 현탁하여 애기장대 종자를 층화하고 4°C(빛 없음)에서 3-4일 동안 보관합니다.
      메모: 야생형 배경 대조군(예: Col-0)과 면역 산출량이 높거나 낮은 유전자형(예: 각각 cpk28-1 및 bak1-5)을 계층화하여 내부 대조군 역할을 합니다.
   2. 토양에 씨앗을 뿌리고 표준 단일 조건 (22 ° C, 10 시간 광, 150 μE / m² / s 광 강도 및 65-70 % 상대 습도)에서 발아합니다.
   3. 약 7일 후, 집게를 사용하여 개별 묘목을 새 화분에 이식하고 최소 4cm 간격을 두고 완전한 로제트 발달을 허용합니다. 유전자형당 6-12개의 묘목을 이식하고 표준 단일 조건으로 돌아갑니다. 정기적으로 식물에 물을 주고 비료를 주십시오(2주마다 20-20-20 비료 1g/L).
2. 하룻밤 동안 회복할 수 있도록 96웰 플레이트에 잎 디스크를 수집합니다.
   1. 발아 후 4-5주(그림 1A)에 날카로운 4mm 생검 펀치를 사용하여 식물당 하나의 잎 디스크를 제거하고 중간 정맥을 피하고 상처를 제한하도록 주의합니다(그림 1B). 건조를 방지하기 위해 100μL의 이중 증류수(ddH₂O)가 들어있는 사용하지 않은 96웰 광도계 플레이트에 잎 디스크를 놓고 인접 면이 위쪽을 향하도록 합니다(그림 1C). 여러 elicitor를 평가하는 경우 각 elicitor 처리에 대해 동일한 잎에서 1개의 잎 디스크를 제거합니다.
      메모: 표본 잎은 완전히 확장되고, 로제트 상단에서 세 번째에서 다섯 번째로, 변동성을 제한하기 위해 크기와 나이가 거의 같습니다. 가능하면 하룻밤 동안 회복하기 전에 면도날을 사용하여 잎 디스크를 반으로 자르면 유도체 용액에 노출되는 표면적이 증가합니다.
   2. 잎 디스크 채취 중 상처로 인해 생성되는 ROS의 간섭을 방지하기 위해 실온에서 밤새 회수합니다. 증발을 방지하기 위해 뚜껑으로 플레이트를 덮으십시오.
3. elicitor 처리를 수행하고 ROS 생산을 측정합니다.
   1. 반응 용액을 추가하기 전에 플레이트 리더를 프로그래밍하면 ROS 버스트 시작과 기록된 첫 번째 측정 사이의 시간을 줄일 수 있습니다. 플레이트 리더기에 적합한 상용 소프트웨어를 사용하십시오. 이 경우(목차 참조) Settings를 클릭하고 LUM96 Cartridge와 Kinetic Read Type을 선택합니다. Read Area(판독 영역) 범주를 클릭하고 드래그하여 판독할 웰의 하위 집합 또는 전체 플레이트를 선택합니다. PMT 및 Optics 탭에서 통합 시간을 1,000ms로 설정합니다. Timing(타이밍) 탭에서 Total Run Time(총 실행 시간)을 40-60분으로, Interval(간격)을 2분으로 설정합니다.
   2. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 우물에서 물을 제거합니다.
      메모: 잎 디스크에 구멍을 뚫으면 상처 스트레스가 발생하고 더 다양한 ROS 출력이 발생할 수 있습니다.
   3. 100μM 루미놀, 10μg/mL 양고추냉이 과산화효소(HRP) 및 원하는 농도의 엘리시터(예: 10nM, 10nM, 100nM 또는 1,000nM에서 elf18)를 포함하는 반응 용액을 1개의 96웰 플레이트에 대해 10mL의 용액을 사용하여 멸균 ddH_2O에서 준비합니다.
      메모: 동결건조된 펩타이드를 저결합 튜브의 멸균 H₂O에 용해시켜 10mM 스톡을 만들고 액체 N₂ 에서 급속 동결한 다음 -80 °C에서 보관합니다. 사용할 준비가 되면 원료를 멸균 H₂O로 희석하여 100μM 작업 재고를 생성하고 -20°C에서 보관합니다.
   4. 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 반응 혼합물을 각 웰에 분주하고 동일한 처리의 모든 잎 디스크에 용액을 동시에 첨가합니다. 유도가 없는 경우 기초 ROS 수준을 평가하기 위해 각 유전자형에 대한 대조 반응(elicitor 없음)을 포함합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가시 스펙트럼의 모든 파장에 대한 광 방출을 즉시 측정합니다.
      메모: luminol 및 HRP는 빛에 민감한 시약이므로 저조도에서 반응 용액을 준비하고 적용합니다. 시약을 사용하지 않는 한 얼음 위나 -20°C에 보관하십시오.
   5. 동적 산화 폭발을 포착하기 위해 마이크로플레이트 리더에서 40-60분 동안 2분 간격으로 1,000ms 통합 시간으로 광 방출을 측정합니다(그림 1D).
      메모: 더 긴 통합 시간을 사용하여 분석 감도를 개선하는 동시에 96웰 플레이트의 모든 샘플을 한 번의 간격 내에서 측정할 수 있습니다.

결과

그림 1. 애기장대에서 면역 유도 후 루미놀 기반 산화 버스트 분석. (A) 4-5 주 동안 짧은 낮 조건의 토양에서 식물을 재배합니다. (B) 4mm 생검 펀치를 사용하여 각 식물에서 잎 디스크를 채취하고 ddH2O에서 하룻밤 동안 회복합니다. (C) 반응 용액(100μM 루미놀, 10μg/mL HRP 및 원하는 제거제 농도)을 추가하고 1,000ms의 통합 시간으로 2분 간격으로 40-60분 동안 광 방출을 측정합니다.(D) Col-0(녹색으로 표시), cpk28-1(보라색으로 표시)과 같은 높은 ROS 제어와 관련된 각 유전자형에 대한 평균 광자 수를 결정합니다. 및 bak1-5(주황색으로 표시)와 같은 낮은 ROS 제어.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
20-20-20 비료	식물 prod	10529	1g/L를 물에 섞어 최적의 성장을 위해 2주마다 식물에 바르십시오.
4mm 생검 펀치	메디컬 마트	232-33-34-피	표면적이 0.125cm^2인 코르크 보어 세트도 사용할 수 있습니다.
BioHit mLine 기계식 12 멀티채널 피펫 (30-300 uL)	싸토리우스	725240	모든 멀티채널 피펫을 사용할 수 있으며 필요한 경우 단일 피펫터를 사용할 수 있습니다.
꼬마 요정18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ 바이오랩	CP7211	10mM 스톡 펩타이드를 -80°C의 저단백질 결합 튜브에 보관합니다. 해동되면 -20C에서 100uM 작업 재고를 보관하십시오.
집게	피셔 사이언티픽	제22-327379
양 고추 냉이 Peroxidase	시그마-알드리치	P6782	순수한 물에 녹이십시오. -20°C에서 보관하고 빛을 피해 보관하십시오.
루미놀	시그마-알드리치	A8511	DMSO에서 디졸브합니다. -20°C에서 보관하고 빛을 피해 보관하십시오.
Murisage와 Skoog 기초 소금	Cedarlane 연구소	MSP09-100LT	4C에서 보관하십시오.
토양	SunGrow 원예	선샤인 믹스 #1	다른 토양 유형도 애기장대를 재배하는 데 사용할 수 있습니다. 냄비를 채울 때 물과 섞으십시오.
SpectraMax Paradigm 다중 모드 마이크로플레이트 리더(LUM 모듈	분자 장치		발광을 검출할 수 있는 모든 플레이트 리더를 이러한 분석에 사용할 수 있습니다.
백색 폴리스티렌 96웰 플레이트	피셔 사이언티픽	전화: 07-200-589

년 호 (영문) 포함)