묘목 성장의 면역 유도 억제 측정

초록

출처: Bredow, M. et al., 애기장대 thaliana의 패턴 트리거 산화 버스트 및 묘목 성장 억제 분석. J. Vis. 특급 (147),(2019).

이 비디오는 애기장대 탈리아나 식물의 묘목 성장 억제 분석을 보여줍니다. 면역 펩타이드 유도체의 농도 증가가 묘목 성장에 미치는 영향이 결정됩니다.

프로토콜

1. 묘목 성장 억제 분석

1. 씨앗을 살균하고 Murashige 및 Skoog (MS) 접시에 파종합니다.
   1. 0.8% 한천[w/v]을 포함하는 멸균 절반 강도(0.5x) MS 배지(2.16g/L)를 준비합니다. 층류 후드의 플레이트(90 x 15mm)에 매체를 붓습니다.
   2. 마이크로 원심분리기 튜브에 약 100개의 씨앗을 1mL의 70% 에탄올로 2분 동안 세척하여 살균하고 흡인으로 제거합니다. 40% 표백제 1mL를 넣고 실온에서 17분 동안 부드럽게 흔들어줍니다. 흡인으로 표백제를 제거하고 멸균수 1mL에 5분 동안 3회 세척합니다. 멸균 0.1% 한천 1mL에 재현탁
      메모: 또는 염소 가스 종자 멸균 프로토콜24을 사용합니다.
   3. 피펫을 사용하여 MS 한천 플레이트에 유전자형당 약 100개의 씨앗을 파종하고 층류 후드에 미세 기공 테이프로 밀봉합니다.
      메모: 씨앗을 가까이 두면 나중에 묘목을 이식하기가 어려워질 수 있으므로 가까이 두지 마십시오.
   4. 발아를 동기화하기 위해 3-4일 동안 플레이트를 4°C(빛 없음)에 배치하여 종자를 층화합니다(그림 1A).
2. 면역 엘리시터 펩타이드를 함유한 48웰 플레이트에 묘목을 이식합니다.
   1. 성층 후 플레이트를 짧은 낮 조건(22°C, 10시간 광, 150μE/m²/s 광도 및 65-70% 상대 습도)에서 3-4일 동안 빛으로 이동하여 발아를 허용합니다.
   2. 층류 후드에서 각 48웰 플레이트에 대해 25mL의 MS를 사용하여 1% 자당[w/v]을 함유한 멸균 0.5x MS 액체 매체에 있는 엘리시터 펩타이드 희석액(0nM, 1nM, 10nM, 100nM 및 1,000nM)을 준비합니다. 웰당 500μL의 MS 액체 배지 또는 펩타이드가 함유된 MS 배지를 피펫팅하여 플레이트를 준비합니다. 가능한 경우 플레이트 준비를 위해 반복 피펫터를 사용하여 프로세스를 신속하게 진행하십시오.
      메모: 각 유전자형에 대해 묘목 성장의 고유한 차이를 설명하기 위해 유도체 없이 MS에서 묘목을 성장시킵니다.
   3. 멸균 집게를 사용하여 동일한 크기와 연령의 각 우물에 하나의 묘목을 조심스럽게 이식하여 묘목이 손상되거나 뿌리가 파손되지 않고 뿌리가 미디어에 잠겨 있는지 확인합니다. 각 유전자형에 대해 각 펩타이드 희석액에 최소 6-8개의 묘목을 이식합니다(그림 1B).
      메모: 발아 후 4일에 묘목을 이식하면 뿌리가 짧을수록 조작하기가 더 쉽고 오래된 묘목은 최적의 결과를 얻지 못할 수 있습니다.
   4. 마이크로포어 테이프로 플레이트를 밀봉하고 표준 단일 조건(22°C, 10시간 광도, 150μE/m²/s 광도 및 65-70% 상대 습도)에서 다시 빛으로 이동합니다. 묘목이 8-12일 동안 자랄 수 있도록 합니다.

2. 퍼센트 성장 억제를 결정합니다.

1. 48웰 플레이트에서 묘목을 조심스럽게 제거하고 종이 타월에 두드려 말립니다. 분석 저울에서 묘목의 무게를 측정하고 값을 기록합니다. 가능한 경우 USB 출력이 장착된 분석 저울을 사용하여 스프레드시트에 새로운 중량 값을 기록하십시오. 묘목의 무게를 측정하기 전에 성장 억제를 시각적으로 표시하기 위해 사진을 찍습니다(그림 1C).
2. MS에서 자란 묘목과 비교하여 엘리시터 처리된 묘목의 성장 억제 비율을 다음과 같이 결정합니다.
   
3. 표준 오차 막대가 있는 막대 그래프를 사용하거나 상자 및 수염 플롯을 사용하여 데이터를 플롯하여 실험 간 분산을 더 잘 표시합니다.

결과

그림 1. 애기장대에서 Elicitor-induced seedling growth inhibition assay(애기장대에서 Elicitor-induced seedling growth inhibition assay). (A) MS 한천에 묘목을 파종하고 표준 단일 조건에서 3-4 일 동안 자랍니다. (B) MS 배지 또는 다른 농도의 elf18을 함유하는 MS를 포함하는 48웰 플레이트에 묘목을 이식합니다. (C) 8-12일 후, 묘목 크기를 육안으로 평가한 다음 분석 저울을 사용하여 새로운 무게를 측정하여 성장 억제 비율을 결정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
뚜껑이 있는 8웰 멸균 플레이트	시그마-알드리치	CLS3548
Draft Sheid를 사용한 분석 저울	폭스바겐	폭스바겐-225AC	모든 표준 분석 스케일을 성장 감지 분석에 사용할 수 있지만 직접 컴퓨터 출력이 최적입니다.
BioHit mLine 기계식 12 멀티채널 피펫 (30-300 uL	싸토리우스	725240	모든 멀티채널 피펫을 사용할 수 있으며 필요한 경우 단일 피펫터를 사용할 수 있습니다.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ 바이오랩	CP7211	-80°C에서 10mM 스톡 펩타이드를 저단백질 결합 튜브에 보관하십시오. 해동되면 -20°C에서 100uM 작업 재고를 보관하십시오.
Murisage와 Skoog 기초 소금	Cedarlane 연구소	MSP09-100LT	4°C에서 보관하십시오.
백색 폴리스티렌 96웰 플레이트	피셔 사이언티픽	전화: 07-200-589