면역 유도 시 쌀 조직에서 반응성 산소종 생산을 검출하기 위한 분석

초록

출처: Wang, Y., et al. 화학발광 분석을 통한 쌀의 면역 반응에서 반응성 산소 종 생산의 실시간 검출. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 유도 시 벼 조직에서 활성산소종(ROS) 생산을 실시간으로 검출하기 위한 분석을 보여줍니다. 절단된 칼집 세그먼트와 잎 디스크는 PAMP로 기능하는 박테리아 편모 유래 펩타이드에 노출됩니다. 식물 세포에서 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해 펩타이드가 인식되면 ROS의 빠르고 일시적인 생성이 발생하며, 이는 화학발광 분석을 통해 검출됩니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 다양한 식물 조직에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 PAMP 유도 시 ROS 검출을 위해 쌀 칼집과 잎 디스크가 사용되었습니다. 차이점은 주로 샘플링 방법으로 인해 발생하므로 아래에는 일반적인 절차만 설명되어 있으며 필요한 경우 특정 단계가 언급됩니다.

1. 조직 준비 및 전처리

1. 쌀칼집
   1. ROS 분석 1일 전에 전처리를 위해 날카로운 면도날 또는 수술용 칼날로 10일된 벼 묘목의 칼집을 3mm 조각으로 자릅니다(그림 1B).
   2. 100μL의 이중 증류수(ddH₂O)가 포함된 96웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 25°C의 어둠 속에서 25°C의 어둠 속에서 상처 부상 관련 이온 누출 및 방어 반응을 완화할 수 있는 5개의 칼집 세그먼트를 배치합니다(그림 2).
      메모: 유도 용액에 노출된 일관된 절단 표면 면적을 보장하기 위해 절단을 수직으로 유지하는 것은 재현성이 높은 결과를 얻기 위한 중요한 단계입니다. 세그먼트를 부드럽게 이동합니다. 데이터 변동의 원인이 될 수 있는 세그먼트에 추가 절단이나 상처를 만들지 마십시오. 원칙적으로 ROS 값의 변동이 크기 때문에 각 테스트에는 최소 5번의 반복실험이 포함되어야 합니다. 반복실험 세트가 많을수록 데이터의 신뢰성이 높아집니다.
2. 리프 디스크
   1. 4-6주 된 벼의 잎 디스크(직경 4mm)를 플런저가 있는 생검 펀치를 사용하여 자릅니다. 데이터 변동을 줄이기 위해 항상 메인 틸러의 두 번째 잎(위에서 번호가 매겨짐)의 중간 3분의 1에서 잎 디스크를 자릅니다(그림 1C).
   2. 전처리를 위해 100μL의 ddH₂O가 포함된 96웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 잎 디스크 하나를 놓고 PAMP에 의한 ROS 유도를 방해할 수 있으므로 상처 관련 반응을 완화할 수 있습니다(그림 2).
      메모: 리프 디스크를 부드럽게 조작하십시오. 실험에서 디스크에 데이터 변동을 초래할 수 있는 추가 절단이나 상처를 만들지 마십시오. ROS의 유도는 대부분 절단 가장자리의 세포에서 발생하는데, 이는 쌀 조직 (잎 또는 칼집)의 표면이 소수성 층으로 덮여 있기 때문입니다. 절단 가장자리의 셀만 유도 용액과 접촉합니다(논의 섹션 참조).
   3. 잎 측면과 관련된 변화를 피하기 위해 물 전처리를 위해 마이크로타이터 플레이트의 우물에서 아축 방향 표면이 위를 향하도록 모든 잎 디스크를 떠 있게 유지합니다.

2. 유도 솔루션 준비

1. L-012 분말을 ddH₂O와 함께 20 mM (6.23 mg/mL) 수용액으로 용해시켜 원액을 만듭니다. 그런 다음 원액을 50mM Tris HCl 완충액(pH 7.5)으로 희석하여 최종 농도 500μM L-012에서 작동 용액을 만듭니다. 사용하기 전에 원액을 냉동 상태로 유지하고 작업 용액으로 희석하십시오.
2. PAMP, L-012 및 양고추냉이 과산화효소(HRP; ddH₂O에서 10mg/mL)를 함유하는 유도 용액을 준비합니다. 10mL 유도 용액의 경우 9.4mL의 50mM Tris HCl(pH 7.5) 용액, 400μL의 L-012 용액, 100μL의 HRP 및 100μL의 flg22(PAMP, ddH_2O의 10mM)를 혼합합니다. 음성 대조군의 경우 PAMP.
   대신 100μL의 ddH₂O를 추가합니다. 메모: 쌀 조직에 대한 차가운 스트레스를 피하기 위해 준비된 유도 용액을 실온에 보관하십시오. 필요에 따라 키틴(최종 농도 20ng/mL)과 같은 다른 PAMP도 치료에 사용할 수 있습니다. L-012는 빛에 민감하기 때문에 L-012 용액이 포함된 모든 튜브를 알루미늄 호일로 덮습니다.

3. 참조된 마이크로플레이트 리더로 소프트웨어 시작 및 프로토콜 설정(재료 표 참조)

참고: 마이크로플레이트 리더 소프트웨어의 매개변수를 설정하는 데 시간이 걸립니다. 유도 솔루션을 추가하기 전에 기계와 프로토콜을 준비(한 번의 클릭으로 진행)하는 것이 좋습니다.

1. 소프트웨어를 시작합니다. 실험 버튼을 클릭하여 새 프로토콜을 생성하거나 기존 프로토콜을 사용합니다.
2. 팝업에서 절차를 클릭하여 플레이트를 설정합니다. 플레이트에서 모니터링할 웰을 선택합니다.
3. Start Kinetic을 클릭하여 총 실행 시간과 읽기 간격을 설정합니다. 실험 요구 사항에 따라 실행 시간을 35분 이상으로 설정합니다. 가능한 한 자주 판독값을 얻으려면 최소 간격을 선택하십시오. 적분 시간의 경우 신호 강도에 따라 1초 이상을 선택합니다.
   참고: 판독 간격은 샘플 수와 신호 통합 지속 시간에 따라 다릅니다.
4. Validate (검증) | 확인을 클릭하여 설정을 확인합니다.
5. 팝업에서 Detect the new plate(새 플레이트 감지)를 클릭하고 소프트웨어가 load plate(로드 플레이트) 대화 상자를 표시할 때까지 기다립니다. 테스트할 플레이트를 캐리어에 놓습니다.
6. 여기에서 중지하여 유도 시스템이 설정될 때까지 기다립니다(다음 섹션에서). 유도 시스템이 준비되는 즉시 실행을 클릭하여 읽기를 시작합니다.

4. elicitation 시스템 구축 및 실시간 ROS 생산 측정

1. 전처리된 조직이 들어 있는 웰에서 ddH₂O를 조심스럽게 제거하여 조직 손상이나 건조를 방지합니다.
2. 멀티채널 피펫을 사용하여 200μL의 유도 용액을 조직이 포함된 웰에 추가합니다.
3. 부드럽게 흔들어 섞습니다. 실행을 클릭하여 감지를 시작합니다.
   메모: PAMP 처리를 통해 식물 조직은 ROS에 매우 빠르게 반응하고 생성합니다. 따라서 여러 번의 치료가 있을 때 수술 시간을 줄이기 위해 PAMP가 없는 음성 대조군을 먼저 처리하는 것이 좋습니다. 처리 사이의 유도 지연을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 작동하십시오. 유도 용액의 추가와 검출 시작 사이의 시간이 짧을수록 중요한 실험 데이터를 더 잘 캡처할 수 있습니다.

결과

그림 1: 칼집 샘플링을 위한 벼 묘목의 성장 상태 및 단계와 분석에 사용된 벼집 및 벼잎의 일부. (A) 10일 동안 멸균 조건에서 1/2 MS 배지에서 자란 벼 묘목을 ROS 분석을 위해 샘플링할 수 있습니다. 멸균된 쌀 종자를 1/2 MS 배지에서 배양하고 직경 8.5cm, 높이 15cm의 투명 유리 바이알에서 12시간 광주기/12시간 암흑 광주기로 성장시켰습니다. (B) 잎 칼집의 샘플링 부분의 개략도. 잎집은 10일 된 벼 묘목에서 잘라냈습니다. 잎 칼집의 위치는 뿌리 위와 첫 번째 잎 아래였습니다. (C) 리프 디스크의 샘플링 위치에 대한 개략도. 잎 디스크는 모든 성장 단계에서 건강한 벼 식물의 주요 경운기의 두 번째...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 마이크로타이터 플레이트	이런말	WHB-96-01
FLG22	(주)상곤바이오텍	P20973	팸프
5세대(Gen5	(주)바이오텍		소프트웨어
L-012	후지필름	Tel.: 120-04891	8- 아미노 -5- 클로로 -7- 페닐 -2,3- 디 히드로 피리도 [3,4-d] 피리 다진 -1,4- 디온, CAS # : 143556-24-5
마이크로플레이트 리더	(주)바이오텍	시너지 2
양 고추 냉이의 과산화 효소 (HRP)	시그마	P8375
샘플러	밀텍스	15110-40
트리스	(주)상곤바이오텍	A610195

) (영문) 년