단핵구 단층에서 Fcγ 수용체 주도 식세포작용 연구를 위한 분석

초록

출처: Tong, T. N., et al. Fcγ 수용체 매개 식세포작용을 평가하기 위한 단핵구 단층 분석 사용. J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 말초 혈액의 1차 단핵구를 활용하여 poly D 항체 옵소니화 R₂R₂ 적혈구를 이용한 Fcγ 수용체 매개 식세포작용을 평가하는 단핵구 단층 분석을 보여줍니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 말초 혈액 단핵 세포 분리

1. ACD(acid-citrate-dextrose) 항응고제(노란색 상단 튜브)가 포함된 vacutainers를 사용하여 건강한 기증자 또는 환자로부터 정맥 천자를 통해 인간 전혈을 얻습니다.
   메모: 전혈은 다음 단계로 진행하기 전에 실온(18-22°C)에서 최대 36시간 동안 ACD에 보관할 수 있습니다. 일반적으로 1-2개의 10mL 전혈 진공 튜브가 분석에 충분합니다.
2. 따뜻하고 완전한 RPMI 배지(10% 소 태아 혈청, 20mM HEPES 및 0.01mg/mL 겐타마이신이 보충된 RPMI-1640)에서 전혈을 1:1 v/v로 희석합니다.
3. 제조업체가 권장하는 대로 밀도 구배 원심분리를 사용하여 희석된 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다(재료 목록 참조). 밀도 구배(실온, 18-22 °C로 데움).
   메모: 최적의 혈액 분리를 위해 혈액 혼합물을 적하 방식으로 조심스럽게 층을 이루거나 피펫을 사용하여 계면에서 혼합량을 최소화합니다.
   1. 피펫 팁을 밀도 구배에 가깝게 배치하고 혈액 혼합물이 튜브 측면을 매우 천천히 따라 흐르도록 하여 혈액 혼합물이 밀도 구배의 맨 위에 천천히 층을 이루도록 합니다.
   2. 실험 규모에 따라 3mL의 밀도 구배(15mL 튜브) 위에 10mL의 혈액 혼합물을 층화하거나 15mL의 밀도 구배(50mL 튜브) 위에 35mL의 혈액 혼합물을 층을 이룹니다. 일반적으로 10mL의 전혈은 1,000만 PBMC를 생성하며, 일부 기증자마다 차이가 있습니다.
      메모: 혈액 혼합물과 밀도 구배가 혼합되지 않는 것이 매우 중요합니다. 혈액 혼합물은 밀도 구배 위에 층을 이루고 모든 혈액이 밀도 구배 위에 올 때까지 천천히 상승해야 합니다.
   3. 층을 이룬 혼합물을 700 x g에서 브레이크 없이 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리된 혼합물은 플라즈마, 버피 코트(PBMC 포함), 밀도 구배 물질, 과립구 및 적혈구의 5개 층(위에서 아래로)으로 분리되어야 합니다.
   4. 대부분의 플라즈마를 제거 및 폐기하고 파스퇴르 피펫과 흡입 전구를 사용하여 새 15mL 튜브에 버피 코트(PBMC) 함량을 조심스럽게 회수합니다.
      메모: 버피 코트 층의 제거는 파스퇴르 피펫에 흡입을 가하면서 피펫 끝이 튜브에 닿도록 층 외부 주위를 원형 운동을 수행함으로써 효과적으로 수행됩니다.
4. 분리된 PBMC를 pH 7.3 인산염 완충 식염수(PBS)에서 350 x g에서 10분 동안(완전 브레이크 상태) 원심분리하여 세척 사이에 세 번 세척합니다. PBMC 펠릿을 완전한 RPMI 배지로 재구성합니다. 펠릿의 크기에 따라 3-7mL의 배지로 충분합니다.
5. 트리판 블루와 혈구계를 사용하여 PBMC를 계산합니다. 트리판 블루로 염색되지 않은 세포만 세십시오. 완전한 RPMI 배지에서 PBMC를 1,750,000 cells/mL로 재구성합니다.
6. 400 μL(700,000 세포)를 8 챔버 슬라이드의 각 웰에 시딩합니다. 37°C의 완전 가습 조직 배양 인큐베이터(5% CO₂ 보충)에서 1시간 동안 슬라이드를 배양하여 단핵구/대식세포가 부착되도록 합니다.

2. 접착된 단핵구의 전처리

참고: 이 단계는 식세포작용을 억제하거나 강화하는 방법을 찾는 경우에만 필요합니다.

1. 부착된 단핵구를 관심 약물 또는 화합물로 전처리합니다. 완전한 RPMI 배지를 사용하여 약물 또는 기타 테스트 재료를 원하는 농도로 재구성합니다.
   메모: 예를 들어, 200μg/mL의 IVIG는 일반적으로 인간 단핵구를 사용할 때 식세포작용을 95-100% 억제하는 데 사용됩니다.
2. 1-h 배양 후(1.6단계 후) 8-챔버 슬라이드에서 비부착 세포를 포함하는 상등액을 흡인하고 폐기합니다. 400 μL의 약물 또는 다른 치료제로 대체하고 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
   1. 8챔버 슬라이드에서 용액을 흡인 및 교체할 때 약하게 부착된 세포가 떠오르지 않도록 유체의 흐름을 제어해야 합니다. 또한 한 번에 2-3개의 빈 우물만 사용하고 우물을 건조시키지 마십시오.
      메모: 일반적으로 각 치료는 기술적 삼중으로 수행됩니다.

3. R₂R₂ 적혈구의 옵소니제이션

참고: 옵소니화된_R2R₂ 적혈구는 FcγR 매개 식세포작용에 대한 양성 대조군으로 사용됩니다. Naive R₂R₂ 는 최대 1 개월 동안 4 ° C에서 Alsever의 용액 (유통 수명 연장을 위해)에 보관해야합니다. Alsever의 용액은 사내에서 제조되며 0.8% w/v 시트르산 삼나트륨(이수화물), 1.9% w/v 포도당, 0.42% w/v 염화나트륨 및 0.05% w/v 구연산(일수화물)으로 구성됩니다. _R2R2세포를 이용할 수 없는 경우,_R1R2,_R1R1, R1r 또는_R2r과 같은 다른 Rh-표현형 세포를 사용할 수 있다.

1. PBS의 R₂R₂ (cDE/cDE) 적혈구를 350 x g에서 각각 5분 동안 원심분리를 사용하여 총 3회 세척합니다.
   메모: 필요한 적혈구의 양은 실험 크기에 따라 다르며 역계산할 수 있습니다. 적혈구는 용해로 인해 또는 상층액을 제거하는 동안 세척할 때마다 손실되므로 항상 과도한 양의 적혈구를 세척하십시오. 예를 들어, 5개의 처리와 2개의 대조군이 있는 실험에서 모두 기술적 삼중으로 수행되면 총 21개의 유정이 있습니다. 1.25% RBC 혼합물의 400μL/웰이 있는 21웰은 105μL의 충전된 옵소니화된 적혈구가 필요함을 나타냅니다. 초기에는 200μL의 적혈구를 세척하고 150μL를 옵소니화하여 식세포작용 단계에 적절한 양의 적혈
구가 있는지 확인해야 합니다.
2. 세척된 R₂R₂ 펠릿을 인간 혈청의 1:1 v/v 다클론 항-D 항체로 Opsonize하고 37°C에서 간헐적 혼합으로 1시간 동안 배양합니다.
   메모: 다클론 항-D 항체를 이용할 수 없는 경우, 시판되는 단클론 항-D 항체 또는 혈액 은행이나 수혈 서비스에서 얻을 수 있는 Rh 면역 예방에 일반적으로 사용되는 항-D를 사용할 수 있습니다. 최적화 검사는 분석을 설정할 때 초기에 수행해야 하며, 역가가 없는 다클론 항체를 많이 전환하거나 단클론 항체로 전환할 때마다 수행해야 합니다. 이는 3+에서 4+ 사이의 항글로불린 검사(IAT) 결과와 계수된 단핵구 100개당 70-90개의 식세포작용된 적혈구의 식세포작용 결과에 필요한 항-D의 최적 농도 또는 부피를 확인하기 위한 것입니다.
3. 옵소니화된 R₂R_{2 를} 350 x g에서 각각 5분 동안 원심분리를 사용하여 PBS에서 총 3회 세척합니다.
   메모: R2R2의 성공적인 옵소니제이션은 간접 IAT를 수행함으로써 확인할 수 있다. 간단히 말해서, 2차 다클론 항인간 항체를 첨가하여 RBC 표면의 1차 옵소니징 항체와 결합하고, 증폭된 신호는 혈응집의 형태로 관찰될 수 있습니다. 자세한 제조업체 프로토콜은 보충 자료 파일에서 찾을 수 있습니다.
4. 완전한 RPMI 배지를 사용하여 세척된 R₂R₂ 펠릿을 1.25% v/v로 재구성합니다.
   메모: 과량의 옵소니즈된_R2R2는 4°C의 Alsever 용액에 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다.

4. Fc 수용체 매개 식세포작용

1. 8-챔버 슬라이드에서 약물 또는 매체 상등액을 흡입하고 1.25% v/v R₂R₂ 혼합물 400 μL를 추가합니다. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
2. 배양 2시간 후 제조업체의 어댑터를 사용하여 챔버를 제거합니다. 종이 타월에 여분의 R₂R₂를 두드리십시오. 슬라이드가 마르지 않는지 확인하십시오.
3. 100mL 비커에 PBS를 채웁니다. 슬라이드를 앞뒤로 천천히 움직여(약 30-40스트로크) 슬라이드를 담그고 세척하여 식세포작용이 없는_R2R₂의 대부분을 제거합니다.
4. PBS에서 슬라이드를 제거합니다. 종이 타월이나 티슈를 사용하여 여분의 PBS를 두드리고 슬라이드를 자연 건조시킵니다.
5. 공기 건조된 슬라이드를 100% 메탄올에 45초 동안 고정합니다. 그런 다음 고정 슬라이드를 자연 건조시킵니다.
   메모: 슬라이드는 Grünwald-Giemsa 염색21 또는 Wright-Giemsa 염색과 같은 다운스트림 염색과 더 잘 호환되는 다른 방법을 사용하여 고정할 수 있습니다.
6. 사내에서 제작한 Elvanol 장착 매체(또는 시중에서 판매되는 다른 장착 매체)를 사용하여 슬라이드를 장착하고 커버 슬립을 추가합니다.
   메모: Elvanol 장착 매체는 PBS에서 15% w/v 폴리비닐 알코올 수지와 30% v/v 글리세린으로 구성됩니다. 혼합물은 모든 수지가 용해되고 글리세린이 균질하게 혼합될 때까지 가열됩니다. 이것은 시중에서 판매되는 다른 장착 매체로 교체할 수 있습니다.
7. 정량화하기 전에 마운트를 밤새 건조시키십시오.

5. 식세포작용의 정량화

1. 위상차 현미경과 40X 대물 렌즈를 사용하여 최소 200개의 단핵구와 이러한 단핵구 내에서 식세포화된 R₂R₂의 수를 계수하여 식세포 이벤트의 양을 수동으로 정량화합니다. 양손에 하나의 카운터를 가지고 단핵구의 수와 식세포작용된 R₂R₂의 수를 동시에 정량화합니다.
2. phagocytosed_R2R₂ 의 수를 monocytes의 수로 나누고 100을 곱하여 평균 phagocytic index를 구합니다. 데이터를 평균(평균 식세포 지수) ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 1640	RPMI 1640	R8758
인산염 완충 식염수	시그마	D8537
8챔버 슬라이드	랩-테크-ll	154534
R2R2(cDE/cDE) 적혈구			상업적으로 이용 가능(예: http:// www.bio-rad.com/en-ca/product/ 시약-적혈구)
인간 혈청에서 추출한 다클론 항-D	감마 바이오로직스	DIN 02247724	시판되는 단클론 항-D 또는 Rh 면역 글로불린으로 대체 가능
100% 메탄올	칼레돈	6700-1-42
커버 슬립	폭스바겐	48366 067

년 년 년 호