T세포가 혼합된 집단에서 동종반응성 측정(Measuring alloreactivity in a Mixed Population of T Cells)

초록

출처: Juvet, S. C. et al., 이미징 유세포 분석을 사용한 T 세포 동종 반응성 측정.J. Vis. 특급(2017년)

이 동영상은 면역학적 시냅스 형성으로 이어지는 동종 항원 운반 수지상 세포와의 상호 작용을 관찰하여 혼합 T 세포 집단에서 동종 반응을 평가하는 방법을 보여줍니다. 유세포 분석을 통한 시냅스 함유 이중항의 차등 염색 및 정량화는 T 세포 동질활성을 나타냅니다.

프로토콜

1. 필요한 시약 및 재료 준비

1. 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)("세척 완충액")를 준비합니다. 0.1% 비이온성 세제를 함유한 2% 태아 송아지 혈청(FCS)으로 PBS를 준비합니다("perm-wash buffer", 재료표 참조). 1.5% 포름알데히드로 PBS를 준비합니다.
   메모: 포름알데히드는 부식성이며 잠재적으로 발암성이므로 적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 취급해야 합니다.
2. 자기 세포 분리를 위해 2% FBS 및 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유한 PBS("MCS 완충액")를 준비합니다.
3. 디메틸설폭사이드(DMSO)에 50μg/mL 팔로이딘-플루오레세인 이소티오시아네이트(Phalloidin-FITC)를 준비합니다. DMSO에서 1mg/mL 핵 염색제(예: DMSO 또는 비스-벤즈이미드 염료의 경우 1mg/mL 7-아미노 악티노마이신 D(7-AAD), 재료 표 참조)를 준비합니다. 관심 세포와 이미징 유세포 분석기에 적합한 형광 표지 항체를 준비합니다.
4. T 세포의 공급원으로 동물 조직(예: 림프절 및 비장)을 얻고 항원 제시 세포 또는 전구 세포의 공급원으로 동종 동물 조직(예: 비장 및 골수)을 얻습니다.
5. 세포 배양 배지(예: Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI) 1640 또는 10% FBS가 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 50μM 2-메르캅토에탄올, 페니실린 및 스트렙토마이신을 준비하고 24웰 및/또는 96웰 세포 배양 플레이트를 얻습니다.

2. 항원제시세포(APC) 준비

참고: 이론적으로 모든 APC 모집단은 이 방법으로 검사할 수 있습니다. 이 사건에서 APC인 미성숙 마우스 골수 유래 수지상 세포(DC)가 소송을 제기했습니다. 이러한 세포를 생성하기 위한 많은 프로토콜이 존재합니다. 간단히 말해서 다음 프로토콜이 사용되었습니다.

1. 대퇴골 및 경골의 골수를 RPMI 1640 또는 DMEM으로 플러시합니다.
2. 부유 세포를 70μm 세포 여과기에 통과시켜 작은 뼈 조각과 파편을 제거합니다.
3. 원심분리로 세포를 펠렛화한 다음 실온에서 5분 동안 염화암모늄 완충액을 사용하여 적혈구를 용해합니다.
4. 원심분리(400 x g, 5분)로 세포를 펠렛화하고 세포 펠렛을 재현탁합니다.
5. 5 - 10 mL의 세척 버퍼로 세포를 세척하고 원심분리(400 x g, 5분)로 펠렛한 다음 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다.
6. biotinylated anti-CD3 (5 μg/mL), anti-B220 (5 μg/mL), anti-MHC class II (1 μg/mL) 및 anti-CD11b (5 μg/mL) 항체로 세포를 라벨링하여 세포 분리 컬럼에 걸쳐 조혈 전구체를 풍부하게 합니다.
7. 원심분리(400 x g, 5분)로 세포를 펠렛화하고 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다.
8. 항비오틴 자성 마이크로비드(재료 표 참조)로 세포를 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
9. 세포를 세척 및 펠렛화(400 x g, 5분)한 후 1mL의 MCS 완충액에 다시 현탁시킨 후 3mL의 MCS 완충액으로 프라이밍하고 자석에 넣은 대형 포지티브 선택(LS) 자기 세포 분리 컬럼을 사용하여 라벨링된 세포를 제거합니다. MCS 완충액 3mL로 컬럼을 3회 세척합니다. 플로우 스루에는 원하는 셀이 포함됩니다.
10. 컬럼을 통과하는 세포를 2ng/mL 재조합 마우스 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)와 2ng/mL의 재조합 인간 형질전환 성장 인자 β1(TGFβ1)이 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM에서 6일 동안 배양합니다. 2일마다 배지의 절반을 2ng/mL GM-CSF 및 TGFβ1을 함유한 새로운 완전 배지로 교체하십시오.
    참고: 인간 TGFβ1은 마우스 세포에서 활성을 가지고 있습니다. 이러한 미성숙한 DC를 사용하여 데이터가 생성되었습니다. 다른 세포(예를 들어, B 세포 및 성숙한 DC)는 APC로서 적합할 수 있지만, 이 분석에서는 시험되지 않았다.
11. DC를 90% 혈청/10% DMSO에 동결 보존하고 액체 질소에 보관합니다. 사용 당일에 회복합니다. 사용하기 전에 trypan blue exclusion을 사용하여 혈구계에서 생존 가능한 DC의 수를 계산합니다. 섹션 4에서 사용하기 전에 적절한 밀도(단계 4.1 참조)의 배양 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

3. T 세포 준비

1. 음성 선택 방법을 사용하여 활성화 또는 억제 신호를 실수로 세포에 전달하는 것을 방지합니다.
   참고: 이 예에서는 CD4⁺ T 세포를 분석할 준비가 되어 있습니다.
   1. 쥐의 비장에서 CD4⁺ T 세포를 준비하려면 주사기의 플런저를 사용하여 70μm 세포 여과기를 통해 비장을 으깬다. 세척 버퍼로 셀 스트레이너를 세척합니다.
   2. 원심분리(400 x g, 5분)로 부유 세포를 펠렛화한 다음 실온에서 5분 동안 염화암모늄 완충액에 펠렛을 다시 현탁시켜 적혈구를 용해합니다.
   3. 원심분리(400 x g, 5분)로 세포를 펠렛화하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
   4. 5 - 10 mL의 세척 버퍼와 원심분리(400 x g, 5분)로 펠릿으로 세포를 세척합니다. 펠릿을 다시 현탁합니다.
   5. CD8, 주요 조직적합성 복합체 클래스 II(MHC II, 1μg/mL) 및 CD19(5μg/mL)에 대한 비오틴화된 항체로 세포를 염색합니다. 4 °C에서 10분 동안 배양합니다.
   6. 10mL의 세척 버퍼와 펠릿으로 세포를 원심분리(400 x g, 5분)로 세척합니다. 펠릿을 다시 현탁합니다.
   7. 제조업체의 지시에 따라 anti-biotin magnetic microbeads(재료 표 참조)로 세포를 배양합니다.
   8. 10mL의 세척 완충액과 원심분리(400 x g, 5분)로 펠릿으로 세포를 세척하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
   9. 1mL의 MCS 완충액에 세포를 재현탁하고 자석에 3mL의 MCS 완충액으로 프라이밍된 자기 세포 분리 컬럼에서 CD4⁺ T 세포를 농축합니다. MCS 완충액 3mL로 컬럼을 3회 세척합니다. 컬럼 플로우 스루(Column flow-through)에는 농축된 T 세포가 포함됩니다.
2. 표준 유세포 분석법(standard flow cytometry)을 통해 음성으로 선택된 세포의 부분 표본을 사용하여 T 세포 순도를 평가합니다. 플루오로크롬-스트렙타비딘 접합체(컬럼에서 제거되었어야 하는 비오틴 표지 세포를 식별하기 위해)와 항체를 사용하여 관심 T 세포 집단(이 경우 CD4)을 식별하기 위해 세포를 염색합니다. ≥85%의 순도가 허용됩니다.
   1. 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의한 혈구계의 T 세포 계수(≥90% 생존율 허용).
      참고: MCS 버퍼에는 EDTA가 포함되어 있으며, 이는 분석 전에 제거해야 합니다. 이를 위해 원심분리(400 x g, 5분)로 세포를 펠릿화하고 1mL의 세척 버퍼로 세척합니다. 세포를 다시 펠렛화하고(400 x g, 5분) 적절한 밀도의 배양 배지에 다시 현탁시킵니다(4.1단계 참조).

4. T 세포와 DC를 함께 배양

1. 24웰 또는 96웰 세포 배양 플레이트에서 2:1 T: DC 비율로 시드 T 세포 및 DC를 측정합니다. 최종 배양 부피가 24웰 플레이트의 경우 ≤500μL 또는 96웰 플레이트의 경우 ≤50μL인지 확인합니다.
   참고: 부피가 작을수록 세포-세포 상호작용을 촉진하고 후속 고정 완충액을 위한 공간을 확보할 수 있습니다.
   1. 경험적으로 정확한 세포 수를 조정하되, 일반적인 지침으로 웰(96-well plate)당 1 x 10⁶ T 세포 및 0.5 x 10⁶ DCs를 사용합니다. 이는 세포의 최소 수로 간주되어야 하는데, 그 이유는 더 적은 수의 세포를 사용하면 면역 시냅스의 계수가 어렵기 때문입니다.
      1. 세포 수를 늘리려면 5단계(고정) 후에 복제 웰과 풀을 설정합니다.
         참고: 복제 우물을 설정할 때 먼저 모든 우물에 DC를 파종한 다음 모든 우물에 T 세포를 파종하는 것이 좋습니다. 이것은 우물 사이의 배양 시간의 차이를 최소화합니다.
2. 플레이트를 5% CO₂ 분위기에서 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.

5. 플레이트의 셀 고정

1. PBS에서 1.5% 포름알데히드 배양량의 3배를 각 웰에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 세포-세포 상호 작용의 중단을 최소화하기 위해 플레이트에서 세포를 제거하기 전에 세포를 고정하는 것이 중요합니다.
2. 후속 세척 및 염색을 위해 플레이트의 세포를 튜브로 옮깁니다. 이 단계에서는 단일 염색 제어를 위한 추가 셀을 따로 마련합니다. 이러한 대조군 외에도 전체 배양물을 항체 칵테일로 염색해야 합니다(4.1.1단계 참조).

6. 염색 셀

1. 원하는 형광 색소 접합 항체의 칵테일을 함유한 100μL의 세척 완충액에 있는 세포를 실온에서 30분 동안 빛으로부터 보호하여 염색합니다.
   참고: 이 칵테일에는 T 세포 특이적 항체 및 APC 특이적 항체가 포함됩니다. Fluorochromes는 이미징 유세포 분석기의 구성을 사용하여 구별할 수 있도록 선택해야 합니다. 여기에 표시된 실험에서는 청색 형광단 접합 CD11b(5μg/mL, 재료 표 참조) 및 APC 접합 CD90.2(5μg/mL)를 사용했습니다.
2. 1mL의 세척 완충액으로 세포를 세척하고 400 x g에서 5분 동안 원심분리기를 합니다. 상층액을 디캔팅합니다. 팔로이딘 FITC가 함유된 파마워시 완충액에 세포를 0.05-0.5 μg/mL로 재현탁시키고 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   참고: 약 0.1 μg/mL의 Phalloidin FITC 농도는 마우스 세포에 적합하지만 적절한 농도는 공급자, 세포 유형 및 이미징 유세포 분석기에 따라 다를 것으로 예상됩니다.
3. 1mL의 펌/세척 버퍼와 400 x g에서 5분 동안 원심분리로 세포를 세척합니다. 상층액을 디캔팅합니다. 핵 염료가 함유된 파마/세척 완충액에 세포를 적절한 농도(예: 약 25μg/mL 7-AAD)로 재현탁시키고 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. 1mL의 펌/세척 버퍼와 400 x g에서 5분 동안 원심분리로 세포를 세척합니다. 상층액을 디캔팅합니다. 세척 버퍼에서 세포를 한 번 세척하고 펠렛화한 다음 50 - 100 μL의 세척 완충액에 다시 현탁시켜 세포를 뚜껑이 있는 작은 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. 즉시 데이터 수집을 진행하거나 이미징 유세포분석기에서 수집하기 전에 최대 며칠 동안 빛으로부터 보호된 4°C에서 세포를 보관하십시오.
   참고: 셀은 이러한 방식으로 최대 7일 동안 성공적으로 저장되었습니다. 더 긴 저장이 가능할 수 있지만 테스트되지 않았습니다.

7. 데이터 수집

1. 제조업체의 지침에 따라 이미징 유세포 분석기를 초기화하고 구성합니다. 데이터를 수집하기 전에 흐름 코어의 안정성을 확인하십시오.
2. 명시야 이미지 획득을 위해 하나의 채널을 예약합니다. 명시야 채널을 끈 상태에서 단일 염색 제어 데이터를 획득합니다.
   1. "로드" 버튼을 클릭하고 완전히 염색된 샘플(필요한 모든 형광 색소로 염색된 샘플)이 들어 있는 튜브를 홀더에 삽입합니다.
   2. "workspace" 창에서 종횡비가 1에 가까운 영역과 게이트 싱글릿에 대한 종횡비를 사용하여 새 산점도를 선택하고 만듭니다. 사용된 각 채널(수평 축에 있는 채널의 강도)에 대해 새 산점도를 만듭니다.
   3. 각 형광 색소에 대해 positive population을 확인하고 필요한 경우 "Illumination" 상자에서 레이저 전압을 조정합니다.
   4. 튜브를 내리고 첫 번째 단일 염색 튜브를 로드합니다.
   5. "Acquisition Settings" 상자에 샘플 이름을 입력하고 수집해야 하는 이벤트 수를 설정합니다. 단일 염색(보정 제어용)인 경우 1,000 - 2,000개의 이벤트로 충분합니다.
   6. "채널" 상자에서 각 샘플이 염색된 채널을 선택합니다. 단일 염색 제어의 경우 명시야 및 측면 산란을 끈 상태에서 모든 채널을 선택해야 합니다. "Acquisition" 상자 아래에 있는 "Record" 버튼을 클릭합니다. 이벤트 수가 지정된 임계값에 도달하면 수집이 자동으로 중지됩니다.
   7. "Return" 버튼을 클릭하여 튜브를 언로드합니다. 각 단일 얼룩 컨트롤에 대해 7.2.4 - 7.2.6 단계를 반복합니다. 세포 분석기 및 소프트웨어에 따라 수집 중에 그림 1에 표시된 모든 게이트를 설정하지 못할 수 있습니다(분석 중에 보다 정확한 게이팅이 수행됩니다. 섹션 8 참조).
3. 단일 염색 샘플(7.2단계)과 같이 샘플을 획득하되 "Channels" 상자에서 명시야 채널을 포함하여 필요한 모든 채널을 선택합니다.
   1. 데이터를 기록하기 전에 채널 강도가 원하는 세포 집단을 식별하는 데 적합한지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 레이저 설정을 조정하고 7.2단계에 설명된 대로 새 설정을 사용하여 단일 얼룩 컨트롤을 다시 기록합니다.
   2. 각 샘플에 대해 수만 개의 이벤트를 획득합니다.
      메모: 대부분의 조건에서 세포-세포 접촉 이벤트는 전체 세포 수의 소수입니다(대부분은 단일 세포임). 일반적으로 최종 멤브레인 접촉 게이트에서 최소 100개의 이벤트를 갖는 것이 바람직합니다.

결과

그림 1. 동종 반응성 면역 시냅스를 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략. A. 인포커스 이벤트는 텍스트에 설명된 대로 명시야 채널(채널 4, Ch04)을 사용하여 이미지 강도 프로파일(Gradient RMS)의 변화율의 제곱 평균 제곱근을 기반으로 셀 이미지를 검토하여 모든 이벤트에서 게이트됩니다. B. 인포커스 이벤트 중 이중선은 명시야 채널의 면적에 대한 종횡비를 플로팅하여 단일 세포와 구별됩니다. 단일 세포는 종횡비 1에 가깝게 군집되어 있고 더 작은 면적을 갖는 반면, 이중선은 0.5에 가깝고 더 큰 면적을 갖습니다.C. 그런 다음 APC(이 경우 수지상 세포[DC] 마커, CD11c)의 형광 강도를 T 세포 마커(이 경우 CD90.2...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수	다양한	다릅니다
에틸렌디아메네테트라아세트산, 0.5M 용액	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	AM9260G
Triton X-100 비이온성 세제	시그마-알드리치	엑스100
베타-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M3148
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치	D8418
포름알데히드	시그마-알드리치	F1635	용액은 37 % 포름 알데히드이므로 1.5 % 용액에 대해 25 번 희석해야합니다
셀 스트레이너, 70μm 공극 크기	피셔 사이언티픽	08-771-2
팔로이딘-플루오레세인 이소티오시아네이트	시그마-알드리치	P5282
7-아미노악티노마이신 D	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A1310	DMSO에서 재구성
알로피코시아닌-접합 안티-마우스 CD90.2	이바이오사이언스	제17-0902
퍼시픽 블루 활용 안티 마우스 CD11b	이바이오사이언스	Tel.: 48-0112	퍼시픽 블루가 eFluor 450으로 대체되었습니다
비오틴화 안티 마우스 CD3	이바이오사이언스	제13-0032
비오틴화 안티 마우스 MHC 클래스 II	이바이오사이언스	제13-5321
비오틴화 안티 마우스 B220	이바이오사이언스	제13-0452
비오틴화 안티 마우스 CD8	이바이오사이언스	제13-0081
비오틴화 안티 마우스 CD19	이바이오사이언스	제13-0193
안티 비오틴 마이크로비즈	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-090-485
LS 열	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-401
MidiMACS 자기 셀 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-302
재조합 마우스 GM-CSF	페프로텍	315-03
재조합 인간 TGFβ1	페프로텍	100-21	인간 TGFβ1은 마우스 세포에서 활성을 갖습니다
Amnis ImageStream X 마크 II	암니스/EMD 밀리포어	해당 사항 없음	이미징 유세포 분석기, 자세한 내용은 http://www.emdmillipore.com/ 에서 확인할 수 있습니다.
아이디어 소프트웨어	암니스/EMD 밀리포어	해당 사항 없음	무료 다운로드 (등록 필요) : https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
세포 배양 배지	다양한	다릅니다
소 태아 세럼	다양한	다릅니다
세포 배양 플레이트	다양한	다릅니다

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