유세포 분석에 의한 Bronchoalveolar Lavage Fluid에서 면역 세포의 식별 및 계수

초록

출처: Van Hoecke, L. et al., 염증성 세포 침투를 분석하기 위한 쥐 폐의 기관지폐포 세척.J. Vis. 특급(2017년)

이 비디오는 유세포 분석을 사용하여 기관지폐포 세척액에서 다양한 면역 세포를 식별하고 계수하는 방법을 보여줍니다. 초기에는 생존 염료를 사용하여 단일 면역 세포를 식별한 다음 표면 마커 단백질을 차등 염색하여 각 세포 유형을 정확하게 계수할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비

1. 세척액
   1. 100μM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 균형 잡힌 염 용액을 준비합니다.
      메모: 기관지폐포 세척액(BAL) 내 단백질 수치를 측정하려면 BAL 수액에서 프로테아제 활성을 방지하기 위해 프로테아제 억제제를 추가하는 것이 좋습니다.
2. 카테테르
   1. 투명 플라스틱 폴리에틸렌 21G 튜브(내경: 0.58mm, 외경: 0.965mm, 길이: 0.5cm)에 23G 바늘을 삽입하여 카테터를 만듭니다. 미리 만들어진 카테터도 사용할 수 있습니다.
3. 마취제
   1. 말단 마취제, 가급적이면 호흡 정지를 유발하는 마취제를 준비합니다(예: 인산염 완충 식염수(PBS)에 펜토바르비탈나트륨(>100mg/kg) 용액과 같은 바르비투르산염).
      메모: 흡입 마취가 BAL 수액 함량에 영향을 미칠 수 있으므로 흡입 마취 대신 주입 마취를 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어, CO₂ 는 혈액의 pH에 영향을 미치고 결과적으로 다른 화합물의 재분포에 영향을 미칩니다.
4. 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 적혈구 용해 완충액
   1. 8.29g의 염화암모늄(NH₄Cl)과 1g의 중탄산칼륨(KHCO₃)을 100μM EDTA로 1L의 H₂O에 용해하여 ACK 용해 완충액을 준비합니다. 적혈구 용해 완충액은 외부 소스에서도 구입할 수 있습니다.

2. 기관지폐포 세척 (BAL) 수행

1. 카테터를 기관에 삽입
   1. 26G 바늘을 사용하여 치사량의 속효성 바르비투르산염 마취제를 복강내 주사하여 마우스를 안락사시킵니다. 적절한 치사 마취를 확인하려면 집게로 마우스의 뒷발을 꼬집어 발 반사를 확인합니다.
   2. 동물을 수술 플레이트에 등을 대고 놓고 팔다리를 고정하여 마우스를 고정합니다.
   3. 목에 70% 에탄올을 분사하여 소독합니다. 메스를 사용하여 기관 근처의 목 피부를 절개합니다.
   4. 피부를 열어 침샘을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 흉골 근육을 노출시켜 침샘을 분리합니다. 집게를 사용하여 기관 주변 근육을 절개하여 기관을 노출시킵니다.
   5. 집게발을 사용하여 기관 아래에 면사를 놓습니다.
   6. 26g 바늘로 두 개의 연골 고리 사이에 노출된 기관 중앙을 조심스럽게 뚫습니다. 기관이 더 이상 손상되지 않도록 주의하십시오.
   7. 카테터를 기관에 약 0.5cm 삽입합니다. 카테터가 폐 구조에 손상을 줄 수 있으므로 기관으로 너무 깊이 삽입되지 않도록 하십시오.
   8. 2.1.5단계에서 배치한 면사를 사용하여 카테터 주위의 기관을 묶어 카테터를 안정화합니다. 카테터가 충분히 묶여 있지 않으면 주입된 균형 잡힌 염 용액이 폐로 내려가는 대신 호흡기 상부로 흐를 수 있습니다.
2. 세척액을 모으십시오.
   1. 1mL 주사기에 100μM EDTA가 함유된 1mL의 멸균 균형 염 용액을 로드합니다.
   2. 1mL 주사기를 카테터에 연결하고 염/EDTA 용액을 폐에 부드럽게 주입합니다.
   3. 마우스의 흉부를 마사지하면서 용액을 부드럽게 흡입합니다. 주사기에서 흡입력이 보이지 않으면 카테터를 기관 아래 또는 위로 조금 더 조심스럽게 삽입하십시오.
   4. 바늘에서 주사기를 제거하고 회수된 세척액을 얼음 위에 놓인 15mL 튜브에 옮깁니다. 일반적으로 주입된 용액 1mL에서 700 - 900 μL의 BAL이 회수됩니다.
   5. 2.2.1 - 2.2.4단계를 두 번 더 반복합니다.
      메모: 비세포 함량을 분석하는 것이 목적인 경우 감도 문제가 있을 때 풀링된 샘플을 집중하는 것이 좋습니다.

3. BAL 유체의 세포 및 비세포 구성 요소 수집

1. 세척액을 400 x g 및 4°C에서 7분 동안 원심분리합니다.
2. 상층액을 채취하여 즉시 추가 분석(예: 효소 결합 면역흡착 분석법, ELISA)에 사용하거나 -80°C에서 동결합니다. 폐의 세포 유입을 분석하기 위해 세포 펠렛을 보관하십시오.
3. 세포 펠릿을 200μL의 ACK 용해 완충액에 재현탁시킵니다.
   메모: 이 단계는 백혈구를 그대로 유지하면서 적혈구의 용해를 보장합니다.
4. RT에서 2분 동안 배양합니다.
   메모: 적혈구 용해로 인한 변동을 줄이려면 이 단계를 2분 이상 수행해서는 안 됩니다.
5. ACK 용해 완충액을 희석하기 위해 차가운 PBS 1mL를 추가합니다.
6. 400 x g 및 4°C에서 7분 동안 원심분리기합니다. 상층액을 버리고 다운스트림 분석을 위해 적절한 양의 PBS에 세포를 다시 현탁시킵니다(아래 참조).
   메모: PBS의 양은 수행될 다운스트림 연구에 따라 다릅니다.

4. 유세포 분석에 의한 BAL 유체의 다양한 세포 유형 분석

참고: 한 가지 가능성은 유세포 분석을 수행하여 BAL 유체의 절대 및 상대 세포 구성을 분석하는 것입니다. 이 논문의 목표는 BAL의 기법에 대해 자세히 설명하는 것입니다. 유세포 분석은 그 자체로 전문화된 기법입니다. 유세포 분석 기법에 대한 전문 논문을 읽는 것이 좋습니다. 특정 세포 유형에 특이적인 표면 항원(표 1 참조)을 인식하는 형광단에 결합된 항체가 사용됩니다. 게이팅 전략을 사용하면 BAL의 세포 분획에서 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, B 세포, 호산구 및 호중구를 식별할 수 있습니다.

1. 세포 표면 염색
   메모: 유세포 분석을 위한 모든 중요한 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 3세트의 튜브가 필요합니다(표 2 참조): (1) 샘플을 포함하는 튜브; (2) 단일 염색을 만들기 위해 각 항체-형광단에 대해 BAL 세포가 있는 튜브; 이를 통해 유세포 분석기의 각 채널에 대한 전압을 결정할 수 있습니다. 및 (3) 단일 염색을 만들기 위해 각 항체-형광단에 대한 비드가 있는 튜브; 이것은 보상 매트릭스를 결정하기 위한 것입니다.
   1. 적절한 희석액으로 PBS에서 항체와 Fc-block(anti-CD16/CD32)을 혼합합니다(표 2 참조). 실험 전에 각 항체에 대한 최적의 작동 희석을 결정해야 합니다.
   2. 샘플에 대한 항체 혼합물 50μL에 세포를 재현탁하고 적절하게 희석된 항체 50μL를 중요 대조군에 추가합니다.
      메모: 염색은 96웰의 U자형 플레이트에서 수행할 수 있습니다. 이를 통해 염색량을 쉽게 줄이고 상당한 양의 샘플을 실행할 수 있습니다.
   3. 4 °C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
   4. 400 x g 및 4 °C에서 7분 동안 원심분리기를 사용합니다. 상층액을 폐기합니다.
   5. PBS의 세포를 최종 부피 200μL.
      로 다시 현탁합니다. 메모: 이 최종 부피는 유세포 분석기가 접근할 수 있는 최소 부피에 따라 달라집니다. 이것은 기계마다 약간 다를 수 있습니다. 또한 판독량은 세포 수 및/또는 샘플이 유세포 분석기에서 실행되는 데 걸리는 시간에 따라 달라집니다.
   6. 유세포 분석을 위한 표본 및 대조군을 사용합니다.
      메모: 서로 다른 세포 집단의 절대 세포 수를 결정하려면 카운팅 비드를 추가해야 합니다. 측정 직전에 각 샘플에 동일한 수의 비드(± 25,000개 비드)를 추가합니다. 전방 및 측면 산란을 사용하여 유세포 분석으로 카운팅 비드를 식별할 수 있습니다(그림 1 참조). 그 후, 샘플에 있는 세포의 절대 수는 세포 이벤트에 대한 비드 이벤트의 비율을 비교하여 계산할 수 있습니다. 다음 공식을 사용할 수 있습니다.
      
2. 유세포 분석
   메모: 유세포 분석은 염색 프로토콜이 완료된 직후에 수행해야 합니다. 신호 감지를 위해 적절한 레이저와 필터가 있는 유세포 분석기를 사용해야 합니다.표 3은 이 원고에 설명된 연구에 필요한 레이저 및 필터에 대한 개요를 제공합니다. 유세포 분석에 대한 자세한 내용은 Adan et al.을 참조하십시오.
   1. 파편과 이중선을 제외한 전방 및 측면 산란을 기반으로 기본 게이트를 설정합니다(그림 1 참조).
   2. vol을 조정하십시오.tage 및 스펙트럼 중복에 대한 보상은 단일 염색 세포와 비드의 도움으로 조정됩니다.
      메모: 이러한 설정은 유세포 분석기마다 다르며 모든 실험 전에 확인해야 합니다. 정확한 흐름 분석을 위해서는 순방향 및 측면 산란 전압이 중요합니다. 올바른 전방 및 측면 산란은 분석된 세포의 식별과 확인에 도움이 될 수 있습니다. 이러한 전압을 결정하려면 염색되지 않은 샘플을 먼저 실행해야 합니다.
   3. 표면 항원에 대한 형광 게이트를 설정하고(그림 1 참조) 샘플을 분석합니다.

표 1: 면역 세포 표면 항원 선택.이 표는 다양한 세포 유형을 특성화하는 데 사용되는 표면 항원결정기 목록을 제공합니다. 특정 세포 유형을 안정적으로 정의하기 위해 여러 마커의 조합이 필요합니다.

항원	셀 유형
군집 차별화 3(CD3)	T 세포에서 발현
클러스터 차별화 11c(CD11c)	대부분의 수지상 세포뿐만 아니라 단핵구, 대식세포, 호중구 및 일부 B 세포에서도 많이 발현됩니다.
군집 차별화 11b(CD11b)	단핵구(monocyte), 호중구(neutrophils), 자연살해세포(natural killer cell), 과립구(granulocyte) 및 대식세포(macrophage)를 포함한 많은 백혈구의 표면에서 발현됩니다.
시글렉F	폐포 대식세포 및 호산구.
MHCII	일반적으로 수지상 세포, 단핵 식세포 및 B 세포와 같은 항원 제시 세포에서만 발견됩니다.
CD19	B-림프구 항원
라이-6G	단핵구(monocyte), 과립구(granulocytes), 호중구(neutrophils)에 대한 마커

표 2. 포함할 컨트롤 목록입니다. 이 표는 얻은 결과를 정확하게 해석하는 데 필요한 모든 컨트롤을 보여줍니다.

년 의 년 의 년 의 년 의 년 의 년 의 년 의 년 의 의 년 의 년 의 년 의 년 의 년 의 년 의 년 의 년 의 명 월 명 월 명 년 명 월 명 월 명 년 명 년 명

샘플
관	세포에 첨가되는 항원-형광단	항체 원료 농도(mg/mL)	항체 희석	총 부피(μL)
	고정성 생존도 염료	0.2	1/1000	50
	CD11c	0.2	1/800	50
	시글렉F	0.2	1/100	50
샘플 X	MHCII	0.2	1/200	50
	CD3	0.2	1/200	50
	CD19	0.2	1/200	50
	CD11b	0.2	1/200	50
	라이6G	0.2	1/200	50
전압 제어
관	세포에 첨가되는 항원-형광단	항체 원료 농도(mg/mL)	항체 희석	총 부피(μL)
염색되지 않은 세포	/	/	/	50
단일 염색 세포	고정성 생존도 염료	0.2	1/1000	50
단일 염색 세포	CD11c	0.2	1/800	50
단일 염색 세포	시글렉F	0.2	1/100	50
단일 염색 세포	MHCII	0.2	1/200	50
단일 염색 세포	CD3	0.2	1/200	50
단일 염색 세포	CD19	0.2	1/200	50
단일 염색 세포	CD11b	0.2	1/200	50
단일 염색 세포	라이6G	0.2	1/200	50
보상 제어
관	비드에 첨가되는 항원-형광단	항체 원료 농도(mg/mL)	항체 희석	총 부피(μL)
얼룩지지 않은 구슬	/	/	/	200
단일 스테인 비드	CD11c	0.2	2000년 1	200
단일 스테인 비드	시글렉F	0.2	2000년 1	200
단일 스테인 비드	MHCII	0.2	1/200	200
단일 스테인 비드	CD3	0.2	2000년 1	200
단일 스테인 비드	CD19	0.2	2000년 1	200
단일 스테인 비드	CD11b	0.2	1/400	200
단일 스테인 비드	라이6G	0.2	1/200	200

표 3: 이 연구에서 사용된 유세포분석기의 레이저 및 필터 개요.

레이저 유형	필터 설정
	505 LP	525/50
청색(488nm)	550 LP	575/26
100 mW의	670 LP	35분의 685
	750 LP	60분의 780
바이올렛 405 nm		50분의 450
100 mW의
레드 633 nm		20분의 660
70 mW의	750 LP	60분의 780

결과

그림 1: BAL 유체에서 대식세포, 수지상 세포, T 세포, B 세포, 호중구 및 호산구의 유세포 분석을 위한 게이팅 전략. BAL 세포는 기재된 BAL 프로토콜을 사용하여 분리하였다. 세포는 lipopolysaccharide의 기관내 점안 후 24시간 후에 마우스로부터 분리되었습니다. 카운팅 비드(counting beads)와 세포(cells)는 forward- and side-scatter properties(전방 및 측면 산란 특성)에 따라 식별되었습니다. 세포 게이트에서 단일 세포는 전방 및 측면 산란을 사용하여 식별되었습니다. 이 마지막 집단에서 살아 있는 세포가 확인되었습니다. 그런 다음 CD11c^높은 세포와 CD11c^낮은 세포를 식별했습니다. CD11c가^높은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
균형 잡힌 소금 용액	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	14175-129
에틸렌디아민테트라 아세트산	시그마-알드리치	E6511	자극
23G x 1 1/4 바늘	헨케 사스 울프	4710006030	크기 : 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 닐드	헨케 사스 울프	4710004512	크기 : 0,45 * 12 mm
플라스틱 튜브	BD 의료 기술	427411	폴리에틸렌 튜브, ID 0.58 mm (.023 ") OD . 965mm(0.38인치) 30.5m(100피트)
펜토바르비탈 나트륨	켈라 네바다	514
인산염 완충 식염수	론자	BE17-516F	Ca++ Mg++ 또는 페놀 레드가 없는 PBS; 멸균 여과
1ml 주사기	헨케 사스 울프	5010.200V0	비 발열성 및 비 독성
집게	정밀 과학 도구 GmbH	91197-00
수술용 가위	정밀 과학 도구 GmbH	91460-11
원심분리기 튜브 50ml	일. 가이어	7696705	RNASE/DNASE/내독소 무함유
원심분리기 튜브 15ml	일. 가이어	7696702	RNASE/DNASE/내독소 무함유
마이크로 원심분리기 튜브 1,5ml	시그마-알드리치	0030 120.094	폴리프로필렌
마이크로 원심분리기	시그마-알드리치	5415R
원심 분리기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	75004030
암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액	론자	10-548E	멸균 여과
생사(死)/사(死) -efluor506	이바이오사이언스	Tel.: 65-0866-18	고정성 생존도 염료
CD11c-PE-cy7	e바이오사이언스	Tel.25-0114-81
시글렉F-PE	BD 파밍겐	552126
MHCII-AP플루오르780	바이오레전드	107628
CD3-PE-CY5	폭스바겐	55-0031-U100
CD19-PE-CY5	e바이오사이언스	Tel.: 15-0193-83
CD11B-V450	BD 파밍겐	560455
라이6G-AF700	바이오레전드	127621
절대 계수 비드	라이프 테크놀로지스 유럽 BV	C36950
안티 CD16/CD32	BD 파밍겐	553142
96웰 340μL 보관 플레이트 플레이트	송골매	353263	V-바텀, 천연 폴리프로필렌
유세포 분석기	BD 바이오사이언스
카테테르	BD 바이오사이언스	393202

) 년 의 년 )