마이코박테리아에 대한 테스트 화합물 활성을 평가하기 위한 Charcoal Agar Resazurin 분석

초록

출처: Gold, B. et al., 마이코박테리아의 반정량, 중간 처리량 계수를 위한 Charcoal Agar Resazurin Assay의 시각화. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis에 대한 항균 화합물의 활성을 평가하기 위한 CARA(Charcoal Agar Resazurin Assay)를 보여줍니다. CARA는 박테리아 성장에 미치는 영향을 측정하고 살균 효과와 정균 효과를 구별하여 이러한 화합물의 효능을 평가하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. MIC₉₀ Assay 복제 및 비복제

설정

1. 0.01-0.1의 OD₅₈₀에서 M. tuberculosis, M. bovis BCG 또는 M. smegmatis를 접종하고 Middlebrook 7H9-ADN(0.2% 글리세롤, 0.2% 포도당, 0.5% 알부민 및 0.085% NaCl을 함유하는 Middlebrook 7H9) 또는 7H9-OADC(0.2% 글리세롤 및 10% OADC 보충제를 함유하는 Middlebrook 7H9)에서 중간 로그상(OD₅₈₀ ~0.5)으로 확장.
2. M. tuberculosis 및 M. bovis BCG를 세포 배양 플라스크에서 ~20ml 상설 배양으로 성장시키고 폴리프로필렌 둥근 바닥(4ml 배양) 또는 50ml 원추형 원심분리기 튜브(10-20ml 배양)에서 진탕하여 M. smegmatis를 성장시킵니다. 병원성 마이코박테리아를 37°C에서 20%_O2 및 5% CO₂로 배양하고 M. smegmatis를 37°C에서 20%_O2로 배양합니다.
3. 복제 및 비복제 조건에서 최소 억제 농도(MIC90) 스타일 실험을 설정합니다(그림 1).
   메모: 테스트 에이전트는 일반적으로 96웰 마이크로플레이트당 각각 4개 또는 2개의 화합물을 테스트할 수 있도록 중복 또는 4배로 분석됩니다. 예를 들어, 96웰 플레이트에서 한 테스트 에이전트는 A-D 열에서, 다른 테스트 에이전트는 E-H 열에서 분석할 수 있습니다. DMSO(비히클)는 1열, 2열, 12열에 있으며, 시험제 희석 시리즈는 3열(최저 농도)에서 11열(최고 농도)까지 진행됩니다. MIC90 스타일 분석은 일반적으로 2배 희석 시리즈를 사용합니다. 마이코박테리아에 사용할 수 있는 수많은 비복제 모델이 있으며, 설명을 위해 비복제의 다중 스트레스 모델을 사용하고 있습니다.
   1. 복제 분석의 경우, 0.01의 OD₅₈₀에서 7H9-ADN의 200μl 세포를 바닥이 투명한 조직 배양 처리된 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다.
   2. 비복제 분석법의 경우, 0.02% 틸록사폴을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)에서 세포를 2회 세척하고, 비복제 배지(0.05% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄, 0.005% 구연산철 암모늄, 0.0001% ZnCl₂, 0.1% NH₄Cl, 0.5% BSA, 0.085% NaCl, 0.02% 틸록사폴, 0.05% 부티레이트; 2 N NaOH로 pH 5.0으로 조정)에서 세포를 재현탁시킨다.
      1. 비복제 배지에서 세포를 0.1의 OD₅₈₀으로 희석하고 새로 준비된 1M 스톡의 NaNO₂를 최종 농도 0.5mM까지 첨가합니다.
      2. 0.1의 OD₅₈₀에서 200μl 세포를 바닥이 깨끗하고 조직 배양 처리된 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다.
         메모: DMSO에서 화합물 희석액을 100배 원액으로 준비합니다. 따라서 0.4-100 μg/ml의 최종 농도에서 분자의 충격을 테스트하는 일반적인 MIC 플레이트에는 DMSO에서 0.04-10 mg/ml의 원액이 필요합니다.
   3. 테스트 에이전트 1의 희석액 2μl를 A-E 행에 추가하고 테스트 에이전트 2의 희석액 2μl를 E-H 열에 추가합니다. 철저히 섞는다.
   4. 2μl 차량 제어(보통 DMSO)를 제어 웰, 열 1, 2, 12(열 AH)에 추가합니다. 철저히 섞는다.
   5. 각 실험에 대해 0.004 - 1 μg/ml(복제 분석) 및/또는 0.08 - 20 μg/ml(비복제 분석)의 리팜피신과 같은 하나 이상의 양성 대조군을 포함합니다.
      메모: 0.1 - 25 μg/ml에서 6-bromo-1H-indazol-3-amine9의 사용은 비복제의 다중 스트레스 모델에서 선택적인 NaNO2 의존 활성을 갖는 대조 화합물로 권장됩니다.
   6. 분석 복제를 위해 37°C에서 20% O₂ 및 5% CO₂에서 7일(M. tuberculosis 및 M. bovis BCG) 또는 1-48시간(M. smegmatis) 동안 마이크로플레이트를 배양합니다. 비복제의 다중 스트레스 모델의 경우, 37°C에서 1% O₂ 및 5% CO₂(M. tuberculosis 및 M. bovis BCG)로 7일 동안 마이크로플레이트를 배양합니다.

2. CARA 마이크로플레이트 접종

1. CARA를 판독값으로 사용할 시점에서, 50-75 μl로 설정된 p200 멀티채널 피펫을 사용하여 MIC90 스타일 분석 플레이트의 웰 내용물을 조심스럽게 다시 매달아 놓습니다. 파이펫을 최소 5-10회 위아래로 움직이고 파이펫 팁을 사용하여 웰 내용물을 원을 그리며 부드럽게 소용
돌이칩니다.
2. 10μl의 어세이 웰 내용물을 CARA 마이크로플레이트로 옮깁니다. 분석 플레이트의 웰 내용물 순서가 CARA 마이크로플레이트의 웰 내용물 순서와 일치하는지 확인합니다. 이송 중 튀는 것을 피하고 10μl가 CARA 마이크로플레이트 웰 중간에 묻어 있는지 확인하십시오. 10μl가 CARA 마이크로플레이트에 흡수되는지 확인합니다.
   메모: CARA 마이크로플레이트에서 세포를 발견하기 전에 희석할 필요가 없습니다.
3. CARA 마이크로플레이트 더미를 플레이트 테이프로 묶은 다음 다시 밀봉할 수 있는 비닐 봉지에 넣습니다. 20% O₂ (M. smegmatis) 또는 1% O₂ 및 5% CO₂ (M. tuberculosis 및 M. bovis BCG)로 37 °C에서 CARA 마이크로플레이트를 배양합니다.
4. M. tuberculosis 및 M. bovis BCG의 경우 복제 분석: 7일 동안 배양; M. tuberculosis 및 M. bovis BCG 비복제 분석의 경우 10일 동안 배양; M. smegmatis의 경우 복제 분석법, 1-2일 동안 배양; M. smegmatis의 경우 비복제 분석의 경우 2-3일 동안 배양합니다.
   참고: 시간은 추정치이며 다양한 복제, 비복제 및 스트레스 조건에 따라 수정될 수 있습니다.

3. CARA 마이크로플레이트 개발

1. 박테리아 성장 필름 또는 더 큰 거시적 집락이 네거티브(차량) 제어 웰에서 보일 때 CARA 마이크로플레이트를 현상합니다.
   메모: 장기간 배양 후 CARA 마이크로플레이트 웰은 종종 건조한 것처럼 보이며 멸균 PBS로 웰 내용물을 사전 적시는 것이 좋습니다. 이는 숯이 레사주린을 흡수하는 것을 방지하는 역할을 하며, 이는 낮은 형광 또는 웰 간 변동으로 이어질 수 있습니다.
2. 멀티채널 피펫과 함께 12개의 p200 팁 단일 세트를 사용하여 웰 측면을 따라 40μl의 멸균 PBS를 분주하고 PBS가 한천/박테리아 미세군집체 상단에 분포되도록 합니다.
3. PBS에서 5mg resazurin(0.01% 최종)과 5% Tween-80 50ml를 혼합하여 CARA 현상 시약을 준비합니다. 와류 및 멸균 필터.
   메모: 대안적인 CARA 현상 시약은 상업적으로 제조된 레사주린 액체 용액을 1:1(vol/vol)로 PBS에서 10% Tween80과 혼합하여 제조할 수 있습니다.
4. 12채널 피펫을 사용하여 CARA 마이크로플레이트의 각 웰에 갓 준비된 CARA 현상 시약 50μl를 추가합니다. 암판을 몇 번 앞뒤로 움직여 각 우물의 한천과 박테리아 매트에 시약을 분배하는 데 도움이 됩니다.
5. 플레이트를 다시 밀봉할 수 있는 비닐 봉지에 넣고 37°C에서 M. smegmatis의 경우 최소 30분, M. tuberculosis 또는 M. bovis BCG.
   의 경우 45-60분 동안 배양합니다. 메모: 차량 제어 웰이 첫 1시간 이내에 분홍색으로 변하지 않으면 플레이트를 다시 포장하고 더 오랜 기간 동안 배양할 수 있습니다.
6. 형광을 판독하기 전에 CARA 마이크로플레이트를 뚜껑을 제거한 상태로 실온에서 15분 동안 생물 안전 후드에 넣습니다. 생물 안전 캐비닛 외부에서 BSL3 분광 광도계를 사용하는 경우 플레이트 위에 광학 품질 PCR 스티커를 부착하고 부드러운 종이 타월로 스티커 표면을 부드럽게 눌러 단단히 밀봉합니다.
7. 530 nm에서 여기(excitation)와 590 nm에서 방출(emission at 590 nm)을 사용하여 탑 리드(top read)를 통해 형광을 측정합니다. 플레이트를 비울 필요는 없습니다.

결과

그림 1: 예상 결과와 함께 배물 MIC₉₀ 분석 및 CARA의 개략도. MIC₉₀ 및 CARA 결과는 모두 8가지 가능한 활동에 대해 제시됩니다. MIC₉₀ 마이크로플레이트 웰의 색상 코딩은 흰색(성장 없음) 및 갈색(성장)이며, CARA 마이크로플레이트의 색상 코딩은 검은색(형광 없음) 및 분홍색(레소루핀 형광)입니다. 데이터는 가설입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
미들브룩 7H9	벡턴 디킨슨	271310
미들브룩 7H11	벡턴 디킨슨	제298810
미들브룩 OADC	벡턴 디킨슨	212351
BSA, 열충격	로슈	3118958001
활성탄	시그마
PBS, Dulbecco의 Ca2+ 및 Mg2+ 무료	생명 기술 / Invitrogen	14190-144
트윈 80	시그마	P8074
리팜피신	시그마	R3501
6- 브로 모 -1H- 인다 졸 -3- 아민	알파 에자르	H34095
인산칼륨 일염기성	시그마	P0662
황산마그네슘, 헵타하이드레이트	시그마	M1880
구연산 철 암모늄	시그마	F5879
황산아연, 헵타하이드레이트	시그마	Z0251
염화암모늄	시그마	A9434
부티르산, 액체	시그마	B103500
레사주린 분말	시그마	R7017
소금	J.T. 베이커	4058-01
레사주린 용액 제조	인비트로젠	DAL1100
분광 광도계	분자 장치	M5
96-well, 조직 배양 처리된 마이크로플레이트	코 닝	3595
시약 저장탱크	폭스바겐	89094-678
재밀봉 가능한 비닐 봉지	폭스바겐	Tel.: 395-94602
14 mL 폴리프로필렌 라운드 튜브	코 닝	352059
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	코 닝	352070
75cm2 세포 배양 플라스크	코 닝	431464U

호 년 (영문) (영문) 년 년