대식세포의 TLR-dependent NF-кB/AP-1 transcription factor signaling에 대한 분석

초록

출처: McKiel, L. A., et al. 고분자 표면의 흡착된 단백질층에서 톨 유사 수용체 매개 NF-kB/AP-1 신호 전달을 검사하기 위한 대식세포 리포터 세포 분석. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 대식세포에서 전사 인자인 핵인자-카파-B(NF-κB) 및 활성인자 단백질-1(AP-1)의 톨-유사 수용체(TLR) 의존적 활성을 조사하는 분석을 보여줍니다. TLR은 손상 관련 분자 패턴(DAMP)을 인식하면 전염증 신호 연쇄 반응을 유발하여 NF-κB 및 AP-1을 활성화합니다. 공학적 리포터 대식세포는 NF-κB 및 AP-1 활성화 시 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP)를 생성하며, 이는 발색 반응을 통해 검출됩니다.

프로토콜

1. 배지 및 시약 준비

1. 섬유아세포 매체를 준비합니다. Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM) 450mL, 소 태아 혈청(FBS) 50mL, 페니실린/스트렙토마이신 5mL를 결합합니다. 4°C에서 최대 3개월까지 보관합니다.
2. 리포터 대식세포 성장 배지를 50mL 분취량으로 준비합니다. DMEM 45mL, FBS 5mL, 5μg/mL 마이코플라즈마 제거 시약(Table of Materials) 및 200μg/mL phleomycin D1(Table of Materials)을 결합합니다. 4°C에서 최대 3개월까지 보관합니다.
3. 50mL 분취액에서 리포터 대식세포 분석 배지를 준비합니다. DMEM 45mL, 열 불활성화 FBS(HI-FBS) 5mL, 5μg/mL 마이코플라즈마 제거 시약 및 200μg/mL 플레오마이신 D1을 결합합니다. 4°C에서 최대 3개월까지 보관합니다.

2. 폴리(메틸 메타크릴레이트)로 세포 배양 표면 코팅

1. 20mL 유리 섬광 바이알에 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)를 20mg/mL(예: 클로로포름 5mL에 PMMA 100mg)로 클로로포름에 용해시킵니다. 바이알에 마그네틱 교반 막대를 놓고 모든 고체가 용해될 때까지 최소 2시간 동안 저어줍니다.
   주의: 클로로포름은 흡입하면 해롭습니다. PVA 장갑을 착용한 상태에서 흄 후드에 솔벤트를 사용하십시오.
2. 400μL의 PMMA 용액을 스핀 코터의 붕규산 유리 현미경 슬라이드 중앙에 피펫팅하고 3000rpm에서 2분 동안 회전합니다. 분석에 필요한 슬라이드 수와 물 접촉각 측정을 위해 3-5개의 추가 슬라이드를 준비합니다. 나중에 사용할 수 있도록 슬라이드를 깨끗한 상자(70% 에탄올로 스프레이 및 닦음)에 보관하십시오.
   메모: 스핀 코팅은 종종 평평한 표면에 얇고 균일한 코팅을 증착하는 데 사용됩니다. 스핀 코터는 원심력을 사용하여 코팅 용액을 표면에 펴 바르는 기판을 고속으로 회전시킵니다.
   1. 고니오미터를 사용하여 여분의 코팅된 슬라이드(즉, 세포 배양에 사용되는 슬라이드가 아님) 표면의 두 무작위 위치에서 물 접촉각을 측정하여 유리 표면이 폴리머로 완전히 코팅되었는지 확인합니다.
      알림: 물 접촉각 측정에는 순도가 가장 높은 물(예: 유리 삼중 증류)만 사용해야 합니다.
3. 생물 안전 작업대(BSC)에서 멸균 집게를 사용하고 무균 기술에 따라 8챔버 접착 웰을 PMMA 코팅 슬라이드에 부착합니다. 끈적한 웰 상단을 세게 눌러 단단히 부착되었는지 확인합니다. 부착된 끈적한 웰이 있는 슬라이드를 37°C에서 밤새 배양하여 밀봉을 고정합니다.
   1. 각 웰에 200μL의 세포 배양 등급(내독소 없음) 물을 추가하여 끈적한 웰의 밀봉을 테스트합니다. 실온(RT)에서 60분 동안 배양하고 진행하기 전에 누출이 없는지 확인하십시오. PMMA 코팅을 방해하지 않도록 주의하면서 물을 흡입하십시오.
4. 각 우물에 300μL의 내독소가 없는 물을 첨가하고 사용 전 1시간(3회), 12시간, 24시간 동안 배양하여 잔여 용매를 제거하여 내독소가 없는 물 세척을 수행합니다.
5. 세포 배양에 사용할 슬라이드의 내독소 농도를 테스트합니다. 200μL의 내독소가 없는 시약수(Table of Materials)를 각 슬라이드의 한 웰에 1시간 동안 배양합니다. 종말점 발색 내독소 분석법(Table of Materials)을 사용하여 추출물의 내독소 농도를 측정합니다.
   메모: 다음 프로토콜은 Table of Materials에 나열된 내독소 분석 키트에 특정됩니다.
6. 이 작업에는 발열원이 없는(즉, 내독소가 없는) 것으로 인증된 물과 소모품(예: 피펫 팁, 마이크로 원심분리기 튜브 및 웰 플레이트)만 사용하십시오. 또한 폴리머 코팅 표면의 준비에 사용되는 모든 유리 제품은 사용 전에 건열 살균(250°C에서 30분)을 사용하여 발열원을 제거해야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이 추출물 용액에서 내독소를 측정하면 재료 표면의 내독소가 과소평가될 수 있습니다. 따라서 폴리머 코팅 프로토콜을 개발할 때 코팅된 샘플이 포함된 웰 내에서 직접 내독소 분석 반응(즉, 테스트 샘플[시약 수] 또는 스파이크 대조군의 경우 2.6.4-2.6.6 단계)을 수행하여 코팅 공정 중에 내독소 공급원이 실수로 시스템에 유입되지 않도록 하는 것이 좋습니다.
   1. 모든 테스트 샘플(즉, 추출물)과 내독소 분석 시약을 RT로 가져옵니다. 분석 완충액에 발색성 시약을 재구성하고 시약 물에 내독소 표준물질을 재용해하고 5분 동안 용해시킨 후 사용하기 전에 부드럽게 소용돌이칩니다. 사용하지 않을 때는 모든 병을 파라핀 필름으로 덮으십시오.
   2. 시약 물에서 내독소 표준물질의 연속 희석을 수행하여 분석의 하한에서 상한까지 범위의 내독소 표준물질의 5−8 표준 희석 곡선을 생성합니다.
   3. 테스트 샘플에서 내독소 분석의 강화 또는 억제를 제어하려면 사용하지 않은 테스트 샘플 용액에서 알려진 양의 내독소를 희석하여 양성 대조군(스파이크 대조군 또는 스파이크 샘플이라고도 함)을 준비합니다.
      메모: 양성 대조군의 농도는 표준 곡선의 중간에 있는 표준과 동일한 농도여야 합니다. 내독소 스파이크의 회수된 양(즉, 양성 대조군의 농도에서 스파이크되지 않은 테스트 샘플의 농도를 뺀 값)이 내독소 스파이크의 공칭 농도의 50-200% 이내인 경우, 추출 용액은 분석을 크게 방해하지 않는 것으로 간주될 수 있습니다.
   4. 50μL의 표준물질, 시료 또는 스파이크 대조군을 96웰 플레이트의 각 웰에 중복 또는 삼중으로 추가합니다. 시약수를 음성 대조군으로 사용하십시오.
   5. 모든 웰에 50μL의 발색 시약을 추가합니다. 모든 웰에 시약을 빠르게 첨가하십시오. 타이머를 사용하여 모든 웰에 시약을 추가하는 데 걸리는 시간을 기록합니다. 플레이트를 접착 씰로 덮고 37°C에서 배양합니다(배양 시간은 로트에 따라 다르며 발색 시약 키트에 포함된 분석 인증서에 명시되어 있음). 또는 모든 표준 웰에서 색상 변화가 관찰될 때까지 배양 중 15분마다 플레이트를 확인합니다.
   6. 배양 후 각 웰에 25μL의 50% 아세트산(웰당 10% 아세트산의 최종 농도)을 추가하여 반응을 중지합니다. 발색 시약을 첨가 한 것과 동일한 순서로 아세트산을 첨가한다. 405nm에서 플레이트 리더를 사용하여 플레이트의 흡광도를 읽습니다. 액체를 흡입하고 플레이트를 버립니다.
      메모: 아세트산 첨가는 발색 시약이 걸린 시간과 동일한 시간 (± 30 초)이 각 웰에 첨가하는 데 소요되어야합니다.
7. 자외선(UV)-세포 배양 실험 전에 30분 동안 슬라이드를 살균합니다.

3. 3T3 셀에서 용해물 만들기

1. 여러 T150 플라스크에서 3T3 세포를 70% confluence로 성장시킵니다. 세포를 분리하려면 배지를 흡인하고 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 표면을 세척하고 PBS를 흡인합니다. 동물 유래 성분이 없는 재조합 세포 해리 효소 5mL(재료 표)를 추가하고 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
2. 플라스크를 앞뒤로 부드럽게 기울여 세포를 분리합니다. 세포 해리에 사용되는 재조합 효소를 중화하기 위해 PBS 5mL를 첨가합니다. 플라스크에서 분리된 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 피펫팅을 통해 혼합합니다. 혈구계와 세포 생존도 염료를 사용하여 살아있는 세포 계수를 수행합니다.
   메모: PBS에서 희석을 통해 중화될 수 있는 세포 해리 효소는 용해물 제제에서 혈청 기반 단백질의 도입을 피하기 위해 선택되었습니다. 트립신을 사용하여 세포를 해리하는 경우 혈청 함유 용액으로 중화해야 하며, 용해물 제제로 운반되는 혈청 단백질의 양을 줄이기 위해 추가 PBS 세척을 수행해야 합니다.
3. 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 PBS의 원래 부피(즉, 10mL x 플라스크 수)로 세포를 재현탁하여 남아 있는 배지를 씻어냅니다. 반복하다.
4. 200 x g에서 5분 동안 세포를 다시 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 1 x 10⁶ cells/mL의 최종 세포 농도를 달성하는 데 필요한 PBS의 부피를 추가합니다. 샘플이 완전히 얼 때까지(최소 2시간) -80°C 냉동고에 셀 용액을 넣습니다.
5. 37°C 수조에서 셀 용액을 해동합니다. 완전히 해동되면 용액을 완전히 얼 때까지 -80 °C 냉동고에 다시 넣습니다. 총 3번의 동결-해동 주기에 대해 반복합니다.
6. 단백질 농도를 측정하기 위해 다양한 희석액(예: 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000)으로 세포 용해물에 대한 마이크로 비신초닌산(BCA) 분석을 수행합니다. 세포 용해물을 468.75μg/mL의 단백질 농도로 희석하고 분취한 후 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관합니다.
   메모: 48웰 플레이트의 최종 단백질 농도는 125μg/^cm2(1웰의 표면적 기준, 0.75cm2)입니다.
7. 1.5mm 두께의 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩 버퍼에 있는 40-60μg의 용해물 단백질을 로드하여 용해물(예: heat shock protein 60 [HSP60], high mobility group box 1 [HMGB1])에 DAMPs의 존재를 평가하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하고 표준 웨스턴 블롯 절차를 따릅니다.

4. 대식세포의 NF-κB 활성에 대한 흡착된 단백질층과 톨 유사 수용체의 효과 평가

참고: 실험 워크플로우 및 플레이트 레이아웃의 개략도는 각각 그림 1A와 그림 2를 참조하십시오.

1. 리포터 대식세포를 적절한 크기의 플라스크에서 70% confluence까지 성장시킵니다. 매체를 흡입하고, PBS로 표면을 세척하고, PBS를 흡입합니다. 재조합 세포 해리 효소를 첨가하고 37°C에서 8분 동안 배양합니다.
2. 플라스크의 측면을 단단히 두드려 세포를 분리합니다. 동일한 부피의 성장 배지(10% FBS 함유)를 추가하여 재조합 세포 해리 효소를 비활성화합니다. 혈구계와 세포 생존도 염료를 사용하여 살아있는 세포 계수를 수행합니다.
   메모: 세포 해리 효소에서 8분 동안 배양한 후 리포터 대식세포의 예상 생존 가능성은 90%입니다.
3. 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.상층액을 흡인하고 PBS의 원래 부피로 재현탁하여 세포를 세척합니다. 다시 원심분리하고 분석 배지(열 비활성화 FBS 포함)에서 7.3 x 10⁵ cells/mL로 세포를 재현탁합니다.
4. 세포 현탁액을 3개의 다른 튜브(TLR4 억제제, 항-TLR2 및 미처리)로 분리합니다. RT에서 60분 동안 1μg/mL TLR4 억제제로 세포를 배양하거나 RT에서 30분 동안 50μg/mL anti-TLR2로 세포를 배양합니다.
5. 용해물 200μL, 10% FBS, 상업용 마우스 플라즈마 10%(Table of Materials) 또는 단백질 용액 혼합물을 48웰 플레이트(또는 등가물)에 추가하고 원하는 시간(즉, 30분, 60분 또는 24시간) 동안 37°C에서 단백질이 흡착되도록 합니다. 각 단백질 용액에 대해 새로운 파스퇴르 피펫을 사용하여 웰에서 단백질 용액을 흡입하고 250μL의 PBS로 5분 동안 표면을 세척합니다. 총 3회 세척에 대해 반복합니다.
   메모: 이 단계는 원하는 흡착 시간에 따라 프로토콜에서 더 일찍 시작해야 할 수도 있습니다. 그에 따라 프로토콜을 조정합니다.
6. TLR4 억제제 또는 항-TLR2로 배양 기간 후 세포를 재현탁시킵니다. 각 웰에 200μL의 세포 용액을 추가합니다.
7. TLR2 양성 대조군 조건의 경우 Pam3CSK4(Pam3Cys-Ser-(Lys)4)를 최종 농도 150ng/mL에 추가합니다. TLR4 양성 대조군 조건의 경우 최종 농도 1.5μg/mL에 지질다당류(LPS)를 첨가합니다. 37°C에서 20시간 동안 세포를 배양합니다.
8. 각 웰에서 20μL의 상등액을 샘플링하고 플레이트를 96웰 플레이트에 복제합니다. 20μL 분석 매체의 웰 3개를 배경 대조군으로 포함합니다. 각 웰에 200μL의 SEAP 리포터 분석 시약을 추가합니다. 플레이트를 접착 씰로 덮고 37 ° C에서 2.5 시간 동안 배양합니다 .
   메모: 배양 시간은 실험 조건에 따라 달라질 수 있으며, positive control well과 negative control wells 간의 흡광도에 큰 차이가 있도록 최적화해야 합니다.
   1. 나머지 상등액을 1.5mL 튜브(웰당)로 옮깁니다. 1,000 x g에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 이물질을 펠릿화합니다. 상등액을 새 1.5mL 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관합니다. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 전염증성 사이토카인(예: 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터루킨 6)의 존재 여부에 대해 상등액을 분석합니다.
9. 접착판 씰을 제거합니다. 635nm에서 플레이트 리더를 사용하여 플레이트의 흡광도를 읽습니다. 액체를 흡입하고 플레이트를 버립니다.

결과

그림 1: TCPS, PMMA, PDMS 및 fPTFE에서 NF-кB/AP-1 리포터 대식세포의 알칼리성 인산가수분해효소 분석 방법 및 결과. (A) 리포터 대식세포 알칼리성 인산가수분해효소 분석에 대한 워크플로우 다이어그램. (B) β-actin을 로딩 제어로 사용하여 DAMP 종 HMGB1 및 HSP60의 존재를 확인하는 용해물의 서쪽 블롯. (C) 20시간 동안 배지(음성 대조군), 10% FBS, 용해물 및 Pam3CSK4(TLR2 리간드, 양성 대조군)에서 배양된 리포터 대식세포의 NF-кB/AP-1 활성(흡광도로 표시). 데이터는 한 가지 실험의 결과를 보여주며 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시된 최소 2개의 개별 실험...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 시약
안티 마우스/인간 CD282(TLR2)	바이오레전드	121802
CLI-095 (TLR4 억제제)	인비보젠	TLRL-CLI95
C57 보체 플라즈마 K2 EDTA 10ml, 혁신 등급 미국 원산지	혁신연구(InnovativeResearch)	IGMSC57-K2 EDTA-COMPL-10ml	마우스 플라즈마
둘베코의 변형 독수리 배지(DMEM)	시그마 알드리치	D6429-500ML
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	피셔 사이언티픽	14190250	칼슘 없음, 마그네슘 없음
소 태아 혈청(FBS), 연구 등급	들소	98150
LPS-EK	인비보젠	TLRL-EKLPS	대장균 K12에서 추출한 지방다당류
NIH/3T3 섬유아세포	증권 시세	CRL-1658
팸3CSK4	인비보젠	TLRL-PMS	합성 트리아실화 리포펩티드 - TLR1/2 리간드
페니실린/스트렙토마이신	시그마 알드리치	P4333-100ML
플라즈모신	인비보젠	개미-MPP	마이코플라스마 제거 시약
RAW-블루 셀	인비보젠	원시 SP	NF-κB/AP-1 리포터 대식세포 세포주
트리판 블루 용액, 0.4%	피셔 사이언티픽	15250061
TrypLE 발현 효소 (1X)	피셔 사이언티픽	12604021	동물 유래 성분이 없는 재조합 세포 해리 효소
제오신	인비보젠	개미-ZN-1
키트 및 분석
ELISA 사전 코팅 플레이트, 마우스 IL-6	바이오레전드	B213022
ELISA 사전 코팅 플레이트, 마우스 TNF-α	바이오레전드	B220233
내독소(Escherichia coli) - 제어 표준 내독소(CSE)	Cape Cope, Inc.의 어소시에이트	E0005-5	발색 내독소 분석에서 표준 곡선을 위한 내독소
LAL 물, 100mL	Cape Cope, Inc.의 어소시에이트	WP1001	발색성 내독소 분석법과 함께 사용
마이크로 BCA 단백질 분석	피셔 사이언티픽	PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) 파이로크롬 내독소 테스트 키트	Cape Cope, Inc.의 어소시에이트	C1500-5	발색성 내독소 분석 시약
QUANTI-Blue 알칼리성 인산가수분해효소 검출 배지	인비보젠	렙-qb2	NF-κB/AP-1 활성을 간접적으로 측정하기 위한 알칼리성 포스파타아제 분석
고분자 코팅 시약
클로로포름, 무수	시그마 알드리치	288306-1L
에틸 알코올 무수	상업용 알코올	P006EAAN	Sigma: 시약 알코올, 무수, 676829-1L
직선 테이퍼드 파인 팁 집게	피셔 사이언티픽	16-100-113
Fluorinert FC-40 용매	시그마 알드리치	F9755-100ML	fPTFE용 불소화 용매
세포 배양 등급 물(내독소 없음)	피셔 사이언티픽	SH30529LS
폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA)	시그마 알드리치	182230-25지
Sylgard 184 엘라스토머 키트	피셔 사이언티픽	50822180
테프론-AF(fPTFE)	시그마 알드리치	469610-1지	폴리[4,5-디플루오로-2,2-비스(트리플루오로메틸)-1,3-디옥솔-코-테트라플루오로에틸렌]
소모품
접착 플레이트 씰	피셔 사이언티픽	AB-0580
Axygen 마이크로튜브, 1.5 mL	피셔 사이언티픽	Tel.: 14-222-155
붕규산 유리 섬광 바이알, 흰색 폴리프로필렌 캡 포함	피셔 사이언티픽	03-337-4
투명 PS 48웰 플레이트	피셔 사이언티픽	08-772-52
투명 TCPS 96웰 플레이트	피셔 사이언티픽	08-772-2씨
투명 TCPS 48웰 플레이트	피셔 사이언티픽	08-772-1씨
커버 안경, 서클	피셔 사이언티픽	Tel.: 12-545-81
팔콘 조직 배양 처리 플라스크, T25	피셔 사이언티픽	10-126-10
스티키 슬라이드 8	이비디	80828
Superfrost 현미경 슬라이드	피셔 사이언티픽	제12-550-15
조직 배양 처리된 플라스크, T150	피셔 사이언티픽	08-772-48

시리즈 표시기 (영문) 시리즈 (영문) 호 호 웰 호