CAR T 세포의 효능을 평가하기 위한 실시간 체외 세포분해 분석

초록

출처: Xi, B. et al., 고형 및 혈액 암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포에 대한 실시간 효능 분석.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 실시간 전기 임피던스 측정을 통해 암세포에 대한 CAR T 세포 활성을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 임피던스의 변화를 추적하면 암세포 세포 용해를 유도하는 CAR T 세포의 효과를 평가하여 세포 독성 능력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

1. CAR 인코딩 렌티바이러스 발생

참고: 특정 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 플라스미드 구축이 완료되면(CD47 및 기타), 설명된 대로 293 FT 세포, 렌티바이러스 패키징 혼합물 및 transfection agent(재료 표 참조)를 사용하는 표준 절차에 따라 렌티바이러스 CAR을 생성합니다. 그런 다음 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 키트와 열 순환기(재료 표 참조)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 렌티바이러스 RNA 양을 측정하여 바이러스 역가를 측정합니다. 모든 렌티바이러스 절차는 안전 요구 사항에 따라 엄격하게 수행되는 것이 중요합니다.

1. Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)에 15 x 10⁶ HEK293FT 세포를 파종하고 가습된 5% 이산화탄소(CO₂) 인큐베이터 내부의 150mm 접시 하나에 37°C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.
2. transfection complex가 있는 15mL 튜브 2개를 준비합니다. 첫 번째 튜브에는 2.5mL의 transfection 희석 용액에 lentiviral vector plasmid DNA(5μg)와 lentiviral packaging mix(22.5μg)가 들어 있습니다. 두 번째 튜브에는 2.5mL의 transfection 희석 용액에 82.5μL의 transfection 시약이 들어 있습니다(재료 표 참조).
3. 튜브 1의 내용물을 튜브 2에 피펫으로 넣고 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다.
4. 튜브의 내용물을 HEK293FT 세포의 접시에 적방울로 옮기고 가습된 5% 이산화탄소, CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 샘플을 배양합니다.
5. 다음 날, 기존 배지를 19mL의 새로운 DMEM 배양 배지로 교체하고 37°C에서 가습된 5% CO₂ 배양기 내에서 밤새 세포를 계속 배양합니다.
6. 접시의 매체를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 바이러스 함유 매체가 있는 튜브를 냉장고에 보관하십시오.
7. 위의 절차를 반복하여 새로운 DMEM을 추가하고 1일 후에 다시 수집합니다.
8. 두 개의 매체 모음을 하나의 원심분리기 튜브로 결합합니다. 2,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 튜브를 원심분리합니다.
9. 렌티바이러스가 함유된 상등액 대부분을 초투명 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포 및/또는 파편을 포함할 수 있는 펠릿을 방해하지 않도록 최소 부피, 약 1mL의 상등액을 남겨 두십시오.
10. 위에서 정화한 상층액을 110,000 x g에서 4°C에서 100분 동안 초원심분리합니다.
11. 상층액을 조심스럽게 제거하고 100μL의 DMEM 배지를 튜브 하단의 바이러스 펠릿에 부드럽게 첨가합니다. 튜브를 얼음 위에 15분 동안 그대로 둡니다. 용액을 부드럽게 혼합하고 렌티바이러스 용액을 미리 냉각된 멸균 튜브에 분취합니다. 이 바이러스 스톡 튜브는 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
12. 정량적 RT-PCR 키트를 사용하여 렌티바이러스 RNA를 추출하고 측정하는 제조업체의 프로토콜에 따라 렌티바이러스의 역가를 측정합니다.

2. CAR T 세포의 생성 및 증식

1. 동일한 수의 CD3/CD28 코팅된 마이크로비드(표 참조)와 함께 1mL의 CAR T 세포 배지에서 이전에 동결된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(약 1 x 10⁶ - 2 x 10,⁶ 세포)를 활성화하고 37°C의 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
2. 렌티바이러스 스톡의 분취액을 얼음 위에서 해동합니다.
3. 1μL의 형질도입 강화제를 세포와 함께 웰에 첨가하고 혼합합니다.
4. 5:1의 감염 다중성(MOI)으로 세포에 렌티바이러스를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 다음 날에이 단계를 반복합니다 (첫 번째 형질도입 후 24 시간).
5. 2-3일마다 T 세포 성장을 모니터링합니다. 세포를 1 x 10⁶ - 2 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 유지하기 위해 더 많은 새로운 CAR T 세포 배지를 추가합니다.
6. 동결 용액을 사용하여 표준 프로토콜로 CAR T 세포를 동결합니다(재료 표 참조).
7. 표준 방법을 사용하여 CAR T 세포를 해동하고 분석에 적용하기 전에 인터루킨-2, IL-2(300 units/mL)로 CAR T 세포 배지에서 약 2~4시간 동안 전배양합니다.

3. 유세포 분석에 의한 CAR 발현 검출

1. 3 x 10⁵ CAR T 세포와 비형질 주입 T 세포를 두 개의 별도 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 전달합니다.
2. 300 x g에서 튜브를 2분 동안 원심분리하고 1% 인간 혈청이 포함된 200μL의 FACS(Fluorescence-activated Cell Sorting) 완충액에 세포를 재현탁합니다.
3. 100μL의 세포 용액을 2개의 5mL 폴리스티렌 FACS 튜브에 피펫으로 넣고 튜브를 얼음 위에 5분 동안 유지합니다.
4. 1 μL의 비오틴화 염소 anti-mouse F(ab')₂를 각 세포 유형의 튜브 1개에 추가합니다. 그런 다음 PE 표지 안티 태그 항체인 phycoerythrin 2μL를 각 세포 유형의 다른 튜브에 추가합니다(재료 표 참조). 잘 섞어 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
5. 각 튜브에 3mL의 FACS 완충액으로 세포를 세척하고 300 x g에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상등액과 와류를 매우 짧게 버리거나 튜브를 잠시 흔들어 잔류 액체에 세포를 재현탁시킵니다.
6. 각 튜브에 2μL의 항원제시세포(APC) 항-CD3 및 2μL의 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD) 항체 용액(재료 표 참조)을 추가합니다. 항-F(ab')₂ Ab로 염색된 세포 튜브에 PE 표지 스트렙타비딘 1μL를 추가합니다. 짧게 섞은 후 얼음 위에서 튜브를 30분 더 배양합니다.
7. 3.5단계에서 설명한 대로 FACS 버퍼를 사용하여 셀을 다시 세척하고 각 튜브에 200μL의 FACS 버퍼를 추가합니다.
8. 유세포 분석을 사용하여 전방 산란 대 측면 산란 플롯에서 T 세포에 먼저 게이팅한 다음 CD3 대 7-AAD 플롯에서 살아있는 세포(7-AAD-음성)에 게이팅하여 세포를 분석합니다. 마지막 단계는 anti-tag, anti-ScFv 또는 anti-F(ab')₂ 대 CD3를 분석하는 것입니다.

4. 실시간 세포 분해 효능 분석 (RTCA)

참고: 제조업체의 권장 조건에 따라 RTCA 분석을 수행합니다. 간단히 말해서, 먼저 E-Plate의 웰에 있는 표적 세포를 플레이트에 삽입한 다음 다음 날 CAR T 세포를 추가합니다. 표적 세포에 대한 CAR T 세포의 세포 용해 활성을 실시간으로 모니터링합니다. T 세포 및 모의 형질도입 T 세포(Mock CAR T cell)는 음성 효과기 세포 대조군으로 사용됩니다. 다음 프로토콜은 부착 종양 세포주에 대한 in vitro real-time 세포분해 효능 분석을 설명합니다.

1. xCELLigence E-Plate의 각 웰에 100μL의 타겟 세포 배양 배지를 추가하고, 플레이트를 xCELLigence 기기 내부에 배치한 후 백그라운드 판독을 수행합니다. 그런 다음 세포 파종을 위해 E-Plate를 조직 배양 후드로 옮깁니다.
2. 표준 프로토콜을 사용하여 배양 장치에서 표적 암세포를 트립신화합니다. 그런 다음 세포를 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 최대 15mL의 새로운 배양 배지를 추가합니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상등액을 버리고 5mL의 새로운 배지를 첨가한 다음 혈청학 피펫을 사용하여 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 혈구계와 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 밀도를 계산합니다.
3. 세포 밀도를 적절하게 조정한 다음 E-Plate의 각 웰에 100L의 세포 현탁액을 추가합니다. 표적 세포 수는 일반적으로 부착 세포주(BxPC3, Hela-CD19 및 SKOV3)의 경우 약 10,000 cells/well, 또는 Raji와 같은 현탁 세포의 경우 30,000 cells/well입니다(액체 암 세포를 묶기 위해 항체로 well을 사전 코팅하는 방법에 대한 자세한 내용은 아래 참조).
4. E-Plate를 실온에서 30분 동안 평형을 이루어 세포가 웰 바닥에 고르게 정착할 수 있도록 합니다(이는 매우 중요합니다. 이 단계를 건너뛰지 마십시오).
5. E-Plate를 세포 배양 인큐베이터 내부의 xCELLigence 기기에 넣고 15분마다 자동으로 Cell Index vs. time으로 표시되는 임피던스 측정을 시작합니다.
6. 다음날, 이펙터 CAR T 세포를 준비합니다. 모든 세포가 동시에 준비될 수 있도록 적절한 대조군(즉, 모의 CAR T 세포, 비형질 주입 대조군 T 세포 및/또는 관련 없는 CAR T 세포)을 미리 준비해야 합니다. effector cell과 control cell을 적절한 밀도로 조정하고, 9단계에서 각 well에 100μL의 effector cell suspension을 추가할 때 원하는 E:T 비율이 달성되도록 연속 희석액을 준비합니다.
7. xCELLigence 데이터 수집을 일시 중지하고 인큐베이터의 E-Plate를 세포 배양 후드로 가져옵니다.
8. 각 웰에서 100μL의 배지를 제거합니다. 각 웰의 잔류 배지의 양은 이제 100μL입니다.
9. 100μL의 연속으로 희석된 effector CAR T 세포 또는 기타 대조 세포(즉, 모의 CAR T 세포)를 추가하여 원하는 E:T 비율을 달성합니다.
10. E-Plate를 실온에서 30분 동안 평형을 유지하여 effector cell이 안정화될 수 있도록 한 다음 E-Plate를 xCELLigence 기기에 다시 놓습니다. 데이터 수집을 재개합니다.
11. 원하는 경우, 주요 시점에서 xCELLigence 데이터 수집을 일시 중지하고 플레이트를 제거하여 직교 분석(즉, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 유세포 분석에 의한 사이토카인 생성 측정)으로 분석할 작은 샘플을 수집할 수 있습니다.
12. EGFR-GITR-CD3 CAR T 세포 실험에서 ELISA 키트로 인터페론 감마(IFNγ) 수율을 측정합니다(제조업체의 지침을 따름, 재료 표 참조).
    메모 액체 암의 사용에 관하여: 비부착성 혈액 암 세포를 테스트하기 위해 세포를 추가하기 전에 E-Plate의 웰에 먼저 암세포 표면에서 발현되는 항원에 특이적인 항체를 코팅합니다. Raji B 세포주의 경우 anti-CD40을 기반으로 하는 테더링 시약이 사용됩니다(Table of Materials의 액체 종양 사멸 분석 키트 참조). 다음은 플레이트를 코팅하는 절차입니다.
13. 테더링 버퍼가 있는 테더링 시약(anti-CD40)을 4μg/mL의 농도로 희석합니다.
14. 조직 배양 후드 내부에서 희석된 테더링 시약 50μL를 E-Plate의 각 웰에 추가합니다. E-Plate를 실온 또는 37°C 인큐베이터에 3시간 동안 그대로 둡니다.
15. 테더링 시약을 제거하고 세척 버퍼로 E-Plate를 최소 2회 세척합니다. 이 시점에서 E-Plate는 Raji 타겟 세포(30,000 cells/well)를 파스딩할 준비가 되었습니다.
16. 위의 4.1단계를 계속하여 나머지 절차를 수행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
7-AAD	바이오레전드	420404
Anti-CD40, 액체 종양 사멸 분석 키트	ACEA 바이오사이언스	8100005
반인륜 F(ab')2	잭슨 면역 연구 실험실.	Tel.: 109-116-088
APC 안티 CD3	바이오레전드	317318
분석 매체 RPMI1640	생명 기술. 공사	11875-093
CAR-T 세포 동결액 CryostorCS10	스템셀 기술	#07930
ProMab의 CAR-T 세포 배지	AIM-V+300IFU/ml IL-2	제12055-091
CD3/CD28 코팅 마이크로비즈, Dynabeads	써모피셔	11131D
DMEM을 참조하십시오.	GElifesciences.com	SH30243.02
FACS 버퍼	프로맙 메이드
FBS(증권 시세	Lonza.com	14-503층
HEK293FT	써모 피셔	R70007
INFg ELISA 키트	써모 피셔
렌티바이러스 패키징 믹스	시스템 생명과학	VP100
Lenti-X 정량 RT-PCR 적정 키트(클론텍)	다카라	631235
타겟 세포를 위한 Promab 배지	세포주에 따라 다양함
실시간 세포 분석기	ACEA 바이오사이언스
열 순환기	써모 피셔
형질도입강화제, Virus Transduction Enhancer (Alstem)	트랜스플러스, 알스템	V020
트랜스펙션 희석 용액, Opti-MEM	써모 피셔
트랜스펙션 시약, NanoFect 시약	알스템	NF100

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