1. 미디어 및 솔루션 준비
- 배양 배지 준비: RPMI-1640, 10% 소 태아 혈청(FBS), pH 7.4.
- 분석 배양 배지 준비: 페놀 레드가 없는 RPMI-1640, 1% FBS, pH 7.4.
- 세포 세척 용액 준비: 0.02% EDTA, pH 7.4의 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) Mg 및 Ca-free 용액.
- 세포 분리 용액 준비: 0.125% 트립신과 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA).
- 0.25% 트립신-EDTA 용액 100mL를 해동하고 멸균 500mL 플라스크로 옮깁니다.
- 100mL의 세포 세척 용액과 혼합하고 15mL 분취액을 15mL 멸균 튜브에 분주합니다. 사용할 때까지 -70에서 -80 °C에서 보관하십시오.
- 0.22μm 멤브레인을 통해 이러한 용액을 여과하고 사용하기 전에 최소 30분 동안 37°C까지 예열합니다.
- 3.3μg/mL에서 세포사멸 유도 스톡 용액 TNFα 용액을 준비합니다.
- 20μg의 TNFα를 1차 용기에 500μL의 필터 멸균 물에 용해시키고 완전히 용해될 때까지 혼합합니다.
- 15mL 멸균 튜브로 옮기고 이 튜브에 5.5mL의 DPBS Mg- 및 Ca-free 용액을 추가합니다. 와류 믹서를 사용하여 부드럽게 섞습니다.
- 용액을 70μL 부분으로 분주합니다. 각 부분 표본을 0.5mL 마이크로튜브에 분주하고 -80°C에서 보관합니다.
- 세포사멸 유도 용액 준비: 40ng/mL의 TNFα 용액.
- apoptosis 유도 원액의 부분 표본을 해동하여 25°C의 수조에서 10분 동안 배양합니다.
- 15mL 멸균 튜브에서 4.939mL의 분석 배양 배지에 61μL의 3.3μg/mL TNFα 용액을 첨가하여 세포사멸 유도 스톡 용액을 40ng/mL로 희석합니다.
- 와류 믹서와 10초 동안 혼합하십시오.이 용액은 사용하기 전에 새로 준비해야 합니다.
- 중화 분석에 사용하기 전에 용액을 37°C로 최소 30분 동안 예열합니다.
- 기판 용액 준비: caspase 3/7 Glo 용액.
- 사용하기 전에 카스파제 완충 용액(카스파제 3/7 Glo 완충액)을 12시간 동안 해동합니다.
- 혼합하기 전에 카스파제 완충 용액과 기질(카스파제 3/7 Glo 기질)을 25 ± 5°C에서 30분 동안 별도로 두십시오.
- 카스파제 완충액 용액 10mL를 기질 바이알에 옮기고 반전으로 혼합합니다.
- 25 ± 5 °C에서 사용하고 사용할 때까지 빛을 보호하십시오.
메모: 용액은 실온에서 6시간 동안 안정적입니다.
2. 세포 배양 및 계수
- 세포 해동 및 첫 번째 하위 배양.
- -80°C의 냉동고에서 WEHI 164 셀이 들어 있는 바이알 하나를 꺼내 얼음 수조로 옮깁니다.
- 동결된 세포가 완전히 해동될 때까지 예열된 배양 배지 1mL를 위아래로 피펫팅합니다.
- 예열된 배양 배지 9mL를 15mL 멸균 튜브에 분배합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 멸균 튜브로 옮기고 반전을 통해 5회 부드럽게 혼합합니다.
- 125 x g에서 3분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 버리고 세포 펠릿을 분해합니다.
- 튜브에 5mL의 배양 배지를 추가합니다. 세포가 완전히 재현탁될 때까지 혼합합니다.
- 세포 계수를 위해 50μL의 세포 현탁액을 500μL 마이크로튜브로 옮기고 50μL의 0.4% 트리판 블루와 혼합합니다. 세포를 세고 0.5 x 106 cells/mL로 조정합니다. 아래의 2.2단계를 참조하십시오.
- 예열된 배양 배지 13mL를 75mL 세포 배양 플라스크에 추가합니다.
- 세포 배양 플라스크에서 0.5 x 106 cells/mL를 달성하기 위해 2.1.6단계에서 충분한 세포 현탁액을 분주하고 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양합니다.
- 세포 계수.
- 2.1.6단계의 용액을 사용하여 0.05mL를 혈구계로 옮기고 트리판 블루 배제를 사용하여 현미경으로 세포 밀도를 측정합니다.
- 세포와 생존 가능한 세포의 총 수를 정량화합니다.
- 세포 현탁액을 0.5 x 106 cells/mL.
로 조정합니다.
Vculture medium (mL) = 
V배양 배지(mL) = (5mL - V세포 현탁액)
V배양 배지(mL) = WEHI 164 세포 현탁액의 조정된 부피
NVC = 생존 가능한 WEHI 164 세포/mL
V배양 배지(mL) = 세포 현탁액에 추가된 분석 배양 배지 부피를 0.5 x 106 cells/mL
달성
0.5 x 106 = 목표 세포 밀도
- 세포 분리 및 두 번째 및 세 번째 하위 배양.
메모: 진공 시스템을 사용하여 플라스크에서 용액을 제거할 수 있습니다. 일회용 또는 유리 멸균 피펫을 사용할 수 있습니다. 피펫 상단에 면 막힘이 있는 경우 사용하기 전에 제거해야 합니다.
- 1mL 멸균 피펫과 진공 청소기를 사용하여 세포 배양 T-플라스크에서 배양 배지를 제거합니다.
- 5mL의 세포 세척 용액을 배양 T-플라스크에 분배하고 부드럽게 혼합한 후 용액을 버립니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
메모: 배양 배지를 완전히 제거하는 것은 효율적인 세포 분리를 위해 매우 중요합니다.
- T-플라스크에 세포 분리 용액 15mL를 추가하고 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에서 3분 동안 그대로 둡니다.
- 현미경으로 플라스크의 내벽에 부착된 세포가 없는지 확인합니다. 20mL 멸균 피펫을 사용하여 배양 T-플라스크에서 세포를 제거하고 50mL 멸균 튜브에 분주합니다.
- 125 x g에서 3분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 버리고 펠렛을 다른 5mL의 배양 배지로 재현탁합니다.
- 세포를 계수하고 방정식 1에 따라 원하는 세포 농도에 도달하기에 충분한 배양 배지를 추가합니다.
- 이 현탁액을 72cm2 T-플라스크에 넣고 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양합니다.
- 중화 분석에 사용하기 전에 세포를 최소 2회 계대배양합니다. 다음 2일 동안 2.3.1-2.3.8 단계를 반복합니다.
- 분석 세포 현탁액.
- 3개 이상의 패스가 있는 WEHI 164 하위 문화권을 선택합니다. 2.1단계를 참조하십시오.
- 이 프로토콜의 2.2 및 2.3 단계에 따라 셀을 분리하고 계산합니다.
- 수학식 1에 따라 세포 현탁액을 0.5 x 106 cells/mL로 희석한다.
- 이 세포 현탁액을 중화 분석에 사용하십시오. 사용하기 전에 모든 세포 현탁액을 와류 믹서와 혼합하십시오.
3. 항체 준비 및 희석
- mAb의 정량화.
- 질량 흡광 계수 (1.39).
를 사용하여 280nm에서 UV 흡수를 통해 표준 물질, 대조 시료 및 분석 시료의 농도를 측정합니다.
메모: 원래 농도는 의약품 라벨에서 가져올 수 있습니다. 그러나 이것은 UV 흡수로 확인해야 합니다.
- mAb 희석액.
- 2mL 마이크로튜브에 DPBS Mg- 및 Ca-free 용액을 사용하여 모든 시료를 2mg/mL까지 독립적으로 3회 희석합니다. DPBS Mg- 및 Ca-free 용액을 블랭크로 사용하여 UV 흡수에 의해 이 농도를 확인합니다.
- 볼텍스 믹서를 사용하여 스톡 단백질 용액을 5초 동안 혼합합니다.
- 각 2mg/mL mAb 용액 100μL를 0.9mL의 분석 배양 배지로 희석합니다.
- 소용돌이 믹서로 5초 동안 혼합합니다.
메모: 이러한 용액의 농도는 200μg/mL입니다. 희석은 삼중마다 수행해야 합니다.
- 각 200μg/mL mAb 용액 10μL를 0.99mL의 분석 배양 배지로 희석합니다. 와류 믹서를 사용하여 5초 동안 혼합합니다. 이러한 용액의 농도는 2μg/mL입니다. 중화 분석에 사용하기 전에 각 삼중액에 대해 연속 희석을 수행합니다.
- 3개의 독립적인 마이크로플레이트에서 anti-TNFα mAb 희석액을 만듭니다. 각각의 독립적인 삼중주에서 복제본을 만들고 표 1에 표시된 대로 하나의 마이크로플레이트에 분배합니다. 참조 물질
- 표 2.
와 같이 각 reference , sample 또는 control의 mAb 희석을 수행합니다.
메모: 이 표에 설명된 anti-TNFα mAb 농도는 중화 분석의 최종 농도가 아닙니다.
- 사용할 때까지 플레이트를 25 ± 5 °C로 유지하십시오.
4. WEHI 164 세포를 사용한 중화 분석
- 이 프로토콜의 모든 단계에서 분주하기 전에 모든 세포 현탁액(0.5 x 10,6 cells/mL)을 볼텍싱하여 혼합합니다.
메모: 이 섹션에서는 사용하기 전에 각 용액을 37°C로 30분 동안 가열합니다.
- 50μL의 세포 현탁액을 마이크로플레이트의 60개 웰 각각으로 이동시켜 컬럼 2에서 11로, 라인 B에서 G로 이동합니다.
- 50μL의 mAb 레퍼런스, 샘플 및 제어 희석액을 마이크로플레이트로 전달합니다. 그림 1에 표시된 패턴을 따릅니다.
- 각 웰에 50μL의 세포사멸 유도 용액을 추가합니다.
- 3개의 웰에 분주된 50μL의 WEHI 164 세포에 대한 세포 제어를 사용합니다. 분석 배양 배지를 사용하여 각 웰을 최종 부피 150μL로 가져옵니다.
- 50μL의 WEHI 164 세포와 50μL의 세포사멸 유도 용액의 혼합물에 대한 세포 독성 제어를 사용합니다. 분석 배양 배지를 사용하여 각 웰을 최종 부피 150μL로 가져옵니다.
- TNFα 대조군의 경우 50μL의 세포사멸 유도 용액을 사용하고 분석 배양 배지로 150μL로 가져옵니다.
- 블랭크의 경우 150μL의 분석 배양 배지를 단독으로 사용합니다.
- 플레이트 증발 효과를 방지하기 위해 나머지 웰을 150μL의 배양 배지로 채웁니다.
- 두 개의 다른 마이크로플레이트에서 4.1.1-4.1.9단계를 두 번 반복합니다.
메모: 마이크로플레이트의 mAb 최종 농도는 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 및 0.004μg/mL입니다.
- 그림 1에 표시된 대로 샘플을 마이크로플레이트에 로드합니다
.
- 3 개의 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO2에서 16 ± 2 시간 동안 배양합니다.
- 사용하기 전에 caspase 3/7 Glo 시약을 25 ± 5 °C에서 30분 동안 그대로 두십시오.
- 이 시약 100μL를 샘플과 대조군을 포함한 모든 웰에 추가합니다.
- 웰에 분배한 직후 마이크로플레이트 와류 믹서를 사용하여 25 ± 5°C에서 3분 동안 플레이트를 흔듭니다.
- 플레이트를 빛으로부터 보호하면서 25 ± 5 ° C에서 2.5 ± 0.5 시간 동안 배양합니다.
- 마이크로플레이트를 광도계에 삽입하고 다음 섹션을 완료합니다.
5. 결과 분석
- 발광 감지용 소프트웨어를 사용하여 발광 모드와 엔드포인트 기능을 선택합니다.
- 96웰 투명 바닥 플레이트와 80개의 내부 웰(열 1 및 12 제외)을 선택합니다.
- 판독하기 전에 마이크로플레이트를 혼합하기 위해 1,250ms 및 10초의 통합 시간을 선택합니다.
- 표준 물질, 분석 물질 및 대조 샘플이 배치될 웰을 선택하고 해당 농도로 식별합니다.
- 광도계로 마이크로플레이트에 배치된 샘플을 읽습니다.
- 결과 분석을 위해 네 번째 파라미터 방정식을 사용합니다. 그림 2.
와 같이 용량-반응 곡선을 그래프로 표시합니다.
참고: 네 번째 매개변수 방정식에서 C는 유효 농도 50(EC50)입니다. 이 값은 effector 기능을 통해 기준 물질, 분석 시료 및 대조 시료를 비교하는 데 사용됩니다.
- 상대적 효능을 계산하려면 기준 물질을 100%로 고정하고 샘플의 효능을 계산한 다음 그에 따라 제어합니다.
메모: 이러한 값은 그림 3에 나와 있습니다.
표 1: 마이크로플레이트 샘플 어레이. 완전한 중화 분석은 B2에서 G11까지의 좌표 내에서 3개의 마이크로플레이트에서 실행되어야 합니다. 참조 샘플, 분석 샘플, 대조 샘플의 무작위 분배를 통해 연구자는 분석의 모든 편향을 확인할 수 있습니다.
회
회
회
| 플레이트 1 | 플레이트 2 | 플레이트 3 |
| 웰 스 | 견본 | 웰 스 | 견본 | 웰 스 | 견본 |
| 나2:나11 | 기준 물질 | 나2:나11 | 제어 샘플 | 나2:나11 | 분석 샘플 |
| 시2:C11 | 시2:C11 | 시2:C11 |
| D2:D11 | 분석 샘플 | D2:D11 | 기준 물질 | D2:D11 | 제어 샘플 |
| E2:11 | E2:11 | E2:11 |
| F2:F11 | 제어 샘플 | F2:F11 | 분석 샘플 | F2:F11 | 기준 물질 |
| G2:G11 | G2:G11 | G2:G11 |
표 2: Anti-TNFα mAb 희석액. anti-TNFα mAb의 연속 희석이 이 표에 나와 있습니다. 이 표에 설명된 최종 농도는 항 TNFα mAb가 3배(mAb 희석 + 배양 배지 + 세포 현탁액)로 희석된 분석의 농도가 아닙니다. 굵게 표시된 선은 3, 5, 7, 9 및 10 줄에서 나오는 희석을 나타냅니다. 굵게 표시되지 않은 선은 3, 4, 6행의 희석을 나타냅니다. 이러한 연속 희석은 중화 분석을 수행하기 직전에 수행됩니다. 희석액을 분주하기 전에 위아래로 세 번 피펫팅하여 혼합할 때 주의해야 합니다.
개
의
년
명
년
개
의
명
개
개
의
의
명
의
의
의
의
개
의
의
분
의
의
세
명
세
| 플레이트 컬럼 | 분석 배양 배지의 부피 (μL) | 부피 표준 물질, 분석 시료 또는 대조 시료(uL) | 분석 플레이트의 농도(ng/mL) |
| 2 | 0 | 230 | 2000 |
| 3 | 150 | 2호선에서 150 | 1000 |
| 4 | 75 | 3호선에서 75 | 500 |
| 5 | 100 | 3호선에서 50 | 333 |
| 6 | 75 | 4호선에서 75 | 250 |
| 7 | 75 | 5호선에서 75 | 166 |
| 8 | 75 | 6호선에서 75 | 125 |
| 9 | 75 | 75호선에서 7 | 83 |
| 10 | 75 | 9호선에서 75 | 41 |
| 11 | 150 | 75 호선에서 10 | 13 |
