림프구 증식을 유도하기 위한 백신 펄스 수지상 세포 기반 체외 분석

초록

출처: Liaqat, F., et al., 소 단핵구 유래 수지상 세포를 사용한 백신 면역원성 측정. J. Vis. 특급 (195), (2023).

이 비디오는 상업적으로 이용 가능한 백신의 면역원성을 측정하기 위한 단핵구 유래 수지상 세포, MoDC 기반 분석을 보여줍니다. MoDC 분석은 항원, 병원체 또는 치료제에 대한 수지상 세포 반응을 조사하고 면역 반응, 백신 개발 및 면역 요법 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

1. 나이브 MoDC 제작

참고: 전혈 샘플은 헤파린 액포를 사용한 경정맥 천자에 의해 병원체가 없는 단일 송아지에서 얻었습니다(이 연구에는 8개의 9mL 혈액관이 사용됨). 혈액을 아이스박스에 넣어 운반합니다. 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 2-4°C에 보관하거나 즉시 처리하십시오. 혈액 응고를 방지하기 위해 혈액을 계속 순환시킵니다. 진공 청소기를 70% 에탄올로 살균하십시오. 다음의 모든 실험은 1개의 생물학적 샘플과 6개의 기술적 복제물로 수행되었습니다.

1. 헤파린화된 혈액에서 PBMC를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리
   1. 피를 10번 뒤집어 잘 섞습니다.
   2. 10mL 피펫을 사용하여 20mL의 헤파린화된 혈액을 멸균된 50mL 튜브에 옮기고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석합니다.
   3. 15mL의 림프구 분리 배지를 멸균 50mL 튜브에 피펫팅합니다.
      메모: 파이펫팅 전에 림프구 분리 배지가 실온에 도달하도록 합니다.
   4. 림프구 분리 배지가 들어 있는 50mL 튜브를 45° 위치로 기울입니다. 25mL 피펫의 끝을 수직으로 가리키고 2개를 혼합하지 않고 림프구 분리 배지 위에 30mL의 혈액-PBS를 조심스럽게 겹겹이 쌓습니다. 아주 천천히 50mL 튜브를 수직 위치로 다시 가져옵니다.
   5. 800×g에서 20°C에서 35분 동안 최대 가속 및 제동 없이 원심분리기(감속 기능 꺼짐).
   6. 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBMC 층(플라즈마의 첫 번째 층 바로 뒤에 있는 얇은 흰색 층)을 수집하고 새 50mL 튜브로 옮깁니다.
      메모: 밀도 구배 원심분리는 전혈을 다른 층으로 분리합니다. 그 결과, 적혈구는 펠릿으로 바닥에 침전하고, 단핵 세포(PBMC)는 계면층에 가라앉으며, 혈장은 상층을 형성합니다. 과립구는 펠릿과 PBMC 층 사이에서 발견됩니다.
   7. PBS를 최대 40mL 용량까지 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하여 수확된 PBMC를 2x 세척합니다. 그런 다음 500 × g에서 4 ° C에서 최대 가속 및 최대 감속으로 7 분 동안 원심 분리기를 사용합니다.
   8. 경사 분류에 의해 상등액을 버리고, 펠릿을 1x 암모늄-염화-칼륨(ACK) 완충액 15mL에 재현탁탁하고, 실온에서 10-15분 동안 배양합니다.
      메모: 15분 이상 배양하지 마십시오. 시판되는 ACK 버퍼는 PBMC 분획에 존재하는 잔류 적혈구(RBC)의 용해를 보장하는 데 사용됩니다.
   9. PBS를 최대 40mL까지 첨가한 다음 500×g 및 4°C에서 최대 가속 및 감속으로 7분 동안 원심분리합니다.
   10. 디캔팅으로 상등액을 버리고 1.1.9단계를 반복합니다.
   11. 상등액을 버리고 펠릿을 10mL의 완전 배양 배지(실온에서)에 재현탁합니다.
       메모: 완전한 배양 배지는 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 세포 배양 배지로 구성됩니다.
2. CD14-conjugated magnetic beads를 사용한 PBMC 집단에서 CD14^+/− 세포의 자기 분리
   1. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루(0.4%) 용액을 혼합하여 깨끗한 혈구계 세포 카운터로 세포를 계수합니다.
      참고: 트리판 블루 염료는 독성 화학 물질 및 잠재적인 발암 물질입니다. 접촉을 피하기 위해 개인보호구(PPE)를 착용한 상태에서 취급해야 하며, 폐기물은 밀폐된 특수 독성 폐기물 용기에 넣어 폐기해야 합니다. 죽은 세포는 파란색으로 보이는 반면 살아있는 세포는 현미경으로 선명하게 나타납니다.
   2. 500 × g에서 7분간 원심분리기를 사용합니다.
   3. 피펫을 사용하여 상등액을 폐기하고 1 × 10⁷ 세포마다 40 μL의 부피를 사용하여 펠릿을 형광 활성화 세포 분류 버퍼(FACS)에 재현탁합니다. 피펫을 사용하여 완전히 혼합합니다.
      참고: FACS 완충액은 PBS에 용해된 2% FBS와 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 구성됩니다.
   4. 1 × 10⁷ 세포당 5 μL의 CD14 마이크로비드 완충액을 첨가하고 피펫을 사용하여 완전히 혼합합니다.
   5. 소 CD14⁺ 단핵구의 양성 선택을 위해 4-8°C에서 30분 동안 배양합니다. 잠복기 동안 15분마다 소용돌이
   .
   6. 선택적 단계(유세포 분석용): 10μL의 CD14-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 염색 항체를 추가하고 4-8°C에서 15분 동안 후속 배양합니다. 자세한 내용은 5단계의 유세포 분석을 참조하십시오.
   7. FACS 완충액 1mL를 추가하고 500×g에서 7분 동안 원심분리합니다.
   8. 상등액을 버리고 펠릿을 1 × 10⁸ 세포당 500μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
   9. 면역자기 세포 분리 컬럼을 분리기(마그네틱 컬럼 홀더)에 삽입하고 컬럼 배출구 아래에 15mL 수집 튜브를 배치하여 플로우스루를 수집합니다.
   10. 탈기된 FACS 완충액 1mL로 컬럼을 세척합니다. 헹군 후 사용한 15mL 튜브를 새 것으로 교체하십시오.
   11. 한 번에 500μL의 완충액에 1 × 10⁸개의 세포를 피펫팅하여 세포 현탁액(단계 1.2.8)이 컬럼을 통과할 수 있도록 합니다.
       메모: 세포가 컬럼을 통과하기 전에 세포를 혼합하는 동안 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
   12. 매번 3mL의 탈기된 FACS 버퍼로 컬럼을 3번 헹굽니다.
   13. 플로우스루(flowthrough)를 수집하고, 이 첫 번째 용출된 분획을 CD14⁻ 세포 분획(PBMC에서 CD14⁺ 단핵구를 뺀 값)으로 표시하며, 이를 나이브 림프구 분획(naive lymphocyte fraction)이라고도 합니다.
       메모: CD14⁻ 세포는 항원 펄스 MoDC가 생성될 때까지 완전한 배양 배지에서 유지됩니다.
   14. 구분 기호에서 열을 제거합니다.
   15. 폐수 수집을 위해 컬럼 아래에 새 멸균 15mL 튜브를 놓습니다.
   16. 5mL의 FACS 완충액을 피펫으로 컬럼에 주입하고 플런저를 사용하여 즉시 밀어 넣습니다.
   17. 플로우스루(flowthrough)를 수집하고, 이 두 번째 용출된 분획을 CD14⁺ 세포 분획(cell fraction)으로 표시하며, 이를 나이브 단핵구 분획(naive monocyte fraction)이라고도 합니다.
   18. 수확된 CD14⁺ 단핵구에 완전 배양 배지를 추가하여 1 × 10⁶ cells/mL.
       를 얻습니다. 메모: 용출된 CD14⁺ 세포 분획에서 살아있는 세포를 계수하여 원하는 세포 수를 달성하는 데 필요한 전체 배양 배지의 부피를 추정합니다.
   19. 멸균 24웰 플레이트를 사용하여 각 웰에 1mL의 세포 현탁액(1 ×^{10 6} cells/mL)을 추가합니다.
3. CD14⁺ naive monocyte를 naive MoDC로 분화하여 3% w/v 사이토카인 칵테일(GM-CSF + IL-4)을 총 5일의 배양으로 주입
   1. CD14⁺ 단핵구를 함유한 각 웰에 키트에 제공된 40 μL(3% w/v)의 사이토카인 칵테일을 보충합니다.
   2. 플레이트를 가습 인큐베이터에서 5% CO₂ 및 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
   3. 2일차에 피펫을 사용하여 각 웰 함량의 절반(500 μL)을 개별 1.5 mL 튜브에 옮기고 4 °C에서 7분 동안 500 × g의 원심분리
   를 합니다.
   4. 상등액을 버리고 펠릿을 500μL의 새로운 완전 배양 배지에 재현탁합니다.
   5. 1.3.4단계에서 이 세포 현탁액 500μL를 지정된 각 웰로 다시 옮겨 최종 부피가 1mL가 되도록 합니다.
   6. 각 웰을 20μL의 사이토카인 칵테일로 농축합니다.
   7. 5%_CO2 및 37°C에서 가습된 인큐베이터에서 72시간 동안 배양물을 배양합니다.
   8. 5일째 배양 후 incubator.
      에서 플레이트를 제거합니다. 참고: 각 웰에는 naive MoDC의 세포 현탁액 1mL가 들어 있습니다. MoDC의 수는 도금된 원래 단핵구(1 × 10⁶/mL)의 백분율(~20%)입니다.

2. 항원 펄스 MoDC 생성

참고: 광견병 바이러스(RV)에 대해 상업적으로 이용 가능하고 임상적으로 승인된 백신은 미성숙한 MoDC를 성숙한 항원 제시 MoDC로 분화시킬 수 있습니다. 단일 RV 백신 접종량의 0.1%(~1μL)를 사용하여 항원 펄스 MoDC를 생성합니다. 또한, 나이브 MoDC를 새로운 24웰 플레이트로 옮기면 부정적인 영향을 미치기 때문에 나이브 MoDC를 생성하는 데 사용되는 것과 동일한 배양 플레이트에서 RV 펄스 MoDC를 생산하는 것이 바람직합니다.

1. 24-well 플레이트에서 1mL의 naive MoDC 배양액에 1μL/mL의 RV 현탁액을 추가하고 5% CO₂ 및 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
   참고: RV 자극 없이 배양된 naive MoDC는 배경 대조군으로 사용됩니다(및 다음 단계에서 림프구와의 공동 배양을 위한 비특이적 자극으로).
2. 배양 후 7일째에 항원 펄스 MoDC가 포함된 24웰 플레이트를 얼음 위에 10분 동안 보관합니다.
3. 웰당 얼음처럼 차가운 PBS 1mL를 추가합니다. 피펫팅으로 각 웰을 철저히 혼합하고 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
4. 2mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 웰을 세척하여 각 웰 내에 남아 있는 잔류 세포를 수집합니다.
5. 내용물을 각각의 튜브로 옮기고 500 × g에서 7분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
6. 상등액을 버리고 세포 펠릿(항원 펄스 MoDC)을 완전한 배양 배지에 재현탁하고 부피를 1 × 10⁵ cells/mL.
   의 최종 세포 농도로 조정합니다. 메모: 원하는 세포 수를 달성하는 데 필요한 배지의 부피를 추정하기 위해 살아있는 세포를 계수합니다. MoDC-림프구 공동 배양 시스템에 대해 7일차부터 RV 펄스 MoDC를 사용합니다.

3. MoDC-림프구 공동 배양

참고: 체외 MoDC-림프구 공동 배양 시스템은 항원 특이적 림프구를 프라임하는 MoDC의 능력을 결정합니다. 16일간의 공동 배양 후 세포의 다양한 치료 그룹에는 특이적, 비특이적 및 대조군이 포함됩니다. 특정 그룹은 RV-펄스 MoDC와 공동 배양된 림프구로 정의됩니다. 비특이적 그룹은 비항원 펄스 MoDC와 공동 배양된 림프구로 정의됩니다. 대조군은 MoDC 없이 배양된 림프구로 정의됩니다.

1. 용출된 비정상 림프구 분획(CD14⁻ 세포)에 완전 배양 배지를 추가하여 2 × 10⁶ cells/mL.
   의 세포 농도를 얻습니다. 참고: 수집 이후 24-well plate의 완전한 배양 배지에서 유지된 CD14⁻ 세포 배양에서 살아있는 세포를 계수하여 원하는 세포 수를 달성하는 데 필요한 배지의 부피를 추정합니다.
2. 7일차에 멸균 24웰 플레이트를 취하고 1mL의 비정상 림프구 세포 현탁액(2 × 10⁶ cell/mL)과 1mL의 항원 펄스 또는 비항원 펄스 MoDC 현탁액(1 × 10⁵ cell/mL)을 웰에 파종합니다<> 메모: 각 웰의 총 부피는 웰당 림프구에 대해 1:20 MoDC의 비율로 2mL가 됩니다.
3. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 48 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
4. 항원 펄스 MoDC를 통한 배양 농축 및 재정착
   1. 항원 펄스 MoDC-림프구 공동 배양을 배양한 후 9일째에 각 웰에 20ng/mL 재조합 IL-2를 보충하고 다시 120시간(5일 배양) 동안 계속 배양합니다.
   2. 14일차에 공동 배양 1mL를 멸균 1.5mL 튜브에 옮기고 500×g에서 7분 동안 원심분리합니다.
   3. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 항원 펄스 또는 비펄스 MoDC(1 × 10⁵ cell/mL)로 재현탁합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 세포 현탁액을 지정된 웰로 다시 옮깁니다.
      메모: 이 단계에서 각 웰의 총 부피는 2mL입니다.
   4. 5 % CO₂ 및 37 ° C에서 48 시간 동안 배양을 계속합니다. 16일째 배양 후 공동 배양은 유세포 분석, qPCR 및 ELISA를 사용하여 분석할 준비가 됩니다.
      메모: MoDC-림프구 공동 배양의 각 웰에서 2mL마다 1mL의 재현탁 세포를 유세포 분석을 위해 염색하고, 1mL는 RNA 추출에 사용하며, 두 세포의 상등액은 ELISA에 사용합니다.

4. 유세포 분석

참고: 유세포분석기에서 샘플을 실행하기 전에 적절한 markers/mAb로 세포를 염색합니다. 유세포 분석에 사용되는 시약(염색 mAb 및 동형, 대조군), 키트, 기기 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 유세포 분석기 염색 프로토콜
   메모: anti-CD14 mAb를 사용하여 PBMC와 naive lymphocyte 및 monocyte에 대한 세포 표면 염색을 수행합니다(step 1.2.6). 나이브 MoDC의 세포 표면 염색에는 anti-CD86 특이적, anti-CD40 특이적 및 anti-MHC II 특이적 mAb를 사용합니다. 16일차 공동 배양에서 세포의 세포 표면 염색을 위해 anti-CD4, anti-CD8 및 anti-CD25 mAb를 사용합니다. 세포 내 염색의 경우 anti-Ki-67 mAb를 사용합니다. 또한 음성 동형(negative) isotype control mAb(FMO: 형광 마이너스 1)로 세포를 염색합니다. 표면 및 세포 내 마커를 염색할 때 가장 큰 차이점은 세포 표면 마커의 경우 L/D(live/dead) 염색 또는 기타 공정 전에 세포를 특정 표면 mAb로 염색해야 한다는 것입니다. 그러나 L/D 염색 후 세포 내 염색이 수행되며 세포 내 침투를 허용하기 위해 고정과 투과화 단계가 필요합니다.
   1. 피펫을 사용하여 1mL의 세포 현탁액을 멸균 1.5mL 튜브로 옮기고 500 × g.
      에서 10분 동안 원심분리합니다. 참고: 원심분리 후 MoDC-림프구 공동 배양에서 세포를 처리할 때 ELISA 분석을 위해 상등액을 보관하십시오.
   2. 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 1mL의 PBS를 사용하여 잔류 세포를 수집하고 이를 재현탁 펠릿과 결합합니다.
   3. 세포가 들어 있는 15mL 튜브에 PBS 10mL를 첨가하고 피펫팅으로 혼합한 다음 850 x g에서 7분 동안 원심분리합니다.
   4. 상등액을 버리고 4.1.3단계를 반복합니다.
   5. 상층액을 버리고 상층액을 디캔팅한 후 잔류 현탁액(약 180μL)이 남은 상태로 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.
   6. 셀 현탁액을 v-bottom 96-well plate로 옮기고 well을 밀봉하여 유출을 방지합니다.
   7. 플레이트를 1,400 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 폐기물 용기 위에 플레이트를 튕겨 액체를 비우고 흡수지에 플레이트를 두드려 과도한 액체를 제거합니다.
   8. 웰당 25μL의 표면 염색 마스터 믹스를 추가하고 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합한 다음 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
      메모: 단일 웰에 대한 표면 염색 마스터 믹스를 준비하려면 2.5μL의 표면 mAb를 20μL의 FACS 완충액에 추가합니다.
   9. 웰당 200μL의 FACS 버퍼를 추가하고 1,400×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 디캔팅으로 액체의 우물을 비우고 흡수지에 플레이트를 두드려 과도한 액체를 제거합니다.
   10. 웰당 100μL의 L/D 염색 용액을 추가합니다. 피펫을 사용하여 철저히 혼합한 다음 어두운 곳에서 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
       메모: 단일 웰의 경우 0.25μL의 L/D 염료를 100μL의 FACS 완충액에 용해시킵니다. L/D 염료는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다.
   11. 100μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 뚜껑을 덮고 플레이트를 1,400 × g으로 5분 동안 원심분리합니다. 디캔팅으로 상층액을 버리고 흡수성 종이에 플레이트를 두드립니다.
   12. 4.1.11단계를 반복합니다.
   13. 웰당 50μL의 고정 용액(키트와 함께 제공)을 추가하고 피펫과 혼합한 후 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다.
   14. 키트와 함께 제공된 1x 투과화 세척 완충액(PW) 150μL를 추가하고 웰을 뚜껑으로 덮습니다.
       메모: 10mL의 1x PW 완충액을 준비하려면 10x perm 완충액 1mL를 10mL의 dH₂O에 희석합니다.
   15. 1,400 × g에서 4 °C에서 5 분 동안 플레이트를 원심 분리하고 디캔팅하여 상층액을 버리고 흡수성 종이에 플레이트를 두드려 제거합니다.
   16. 200 μL의 1x PW를 첨가한 다음 1,400 × g에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 디캔팅으로 상층액을 버리고 흡수성 종이에 플레이트를 두드립니다.
   17. 세포 내 염색의 경우 웰당 25μL의 세포 내 염색 마스터 믹스(anti-human Ki-67 mAb)를 추가합니다. 잘 섞고 30 ° C에서 4 분 동안 또는 어두운 곳에서 얼음 위에서 플레이트를 배양합니다 .
       메모: 단일 웰에 대해 세포 내 염색 마스터 믹스를 준비하려면 1μL의 Ki-67 mAb를 24μL의 1x PW에 추가합니다. 세포 내 염색 마커는 16일 공동 배양에서 세포를 처리할 때만 사용됩니다. PBMC, 미접촉 림프구, 단핵구 및 미접촉 MoDC를 처리하는 동안에는 세포 내 염색이 수행되지 않습니다.
   18. 배양 후 각 웰에 200μL의 1x PW를 추가합니다. 피펫과 원심분리기를 1,400 × g 5분 동안 섞습니다. 디캔팅으로 상층액을 버리고 흡수성 종이에 플레이트를 두드립니다.
   19. 200μL의 FACS 완충액을 첨가한 후 1,400×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 디캔팅으로 상층액을 버리고 흡수성 종이에 플레이트를 두드립니다.
   20. 200μL의 FACS 완충액에 세포 펠렛을 재현탁하고 각 웰의 내용물을 별도의 멸균 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다. 웰당 300μL의 FACS 버퍼를 사용하여 잔류 세포를 수집합니다. 이제 세포는 유세포 분석을 위한 준비가 되었습니다.
2. 유세포분석기에서 시료 실행
   메모: 샘플은 제조업체의 설명서에 따라 유세포 분석기(488nm, 638nm 및 405nm 레이저 사용)에서 실행되었습니다. 프로토콜에 대한 자세한 내용, 문제 해결 및 사용자 정의에 대해서는 설명서를 참조하십시오.
   1. 샘플을 읽기 전과 후에 일상적인 세척 절차를 수행합니다.
      메모: 기기에 튜브를 로드하는 동안 위치를 건너뛰지 마십시오.
      1. 세척 주기의 경우 총 4개의 튜브를 사용하며, 첫 번째 튜브에는 흐름 세척 시약이 들어 있고 나머지 3개의 튜브에는 dH₂O가 들어 있습니다.각 튜브에는 3mL가 있습니다. 세척 실행 중에 측면 산란(SSC)의 경우 265V에 대해 전방 산란(FSC)의 경우 330V 미만에서 튜브당 100,000개의 이벤트를 캡처하여 약 1분 동안 중간 유속으로 데이터를 수집합니다.
         메모: 청소하는 동안 파편이나 세포 현상이 보고되어서는 안 됩니다. 이 경우 청소 단계를 다시 수행하십시오. 샘플을 실행하려면 정확한 판독을 보장하기 위해 데이터를 수집하기 전에 모든 샘플이 균일한 현탁액에 있는지 확인하십시오.
   2. 세포분석기를 연결하고 전원을 켜려면 제목 표시줄의 왼쪽 모서리에 있는 응용 프로그램 버튼을 클릭하십시오. 응용 프로그램 드롭다운 메뉴에서 Cytometry 옵션을 선택하고 Power On.
      옵션을 클릭합니다. 메모: 애플리케이션 드롭다운 메뉴에서 Open 옵션을 사용하면 사전 프로그래밍된 분석을 탐색할 수 있으며, New Protocol 옵션을 사용하면 새 프로토콜을 생성할 수 있습니다.
   3. 처음에는 negative control s를 로드합니다.amp다중 튜브 홀더에 le. 새 프로토콜을 선택하고 작업 공간/화면의 왼쪽에 있는 작업 목록을 관찰합니다.
   4. 작업 목록에서 다중 튜브 홀더에서 샘플의 위치를 정의하고 식별을 위해 샘플 및 프로토콜에 이름을 지정합니다.
   5. 작업 공간의 왼쪽에 있는 하드웨어 패널에서 검출기(FSC, SSC 및 10개의 형광 범위), 전압(V) 및 광전자 증배관의 게인, 신호의 AHW(면적-높이-너비)와 같은 여러 매개변수를 조정하고 선택합니다.
      메모: 검출기에 대한 다음 설정은 사용된 실험 및 기기에 따라 선택되었습니다: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8 / FITC 덱스트란) -AHW : A, V : 400, G : 1; FL2 (CD25 / PE) -AHW : A, V : 500, G : 1; FL6 (CD4 / Alexa Fluor 647) -AHW : A, V : 700, G : 1; FL7 (Ki-67 / Alexa Fluor 700) -AHW : A, V : 625, G : 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
   6. 제목 표시줄 아래에 있는 Instrument-Acquisition Control Panel에서 감지하려는 유속(중간), 시간(5분) 및 이벤트(5.2.8단계 참조)에 대한 옵션을 조정합니다. Acquire Single 옵션을 클릭하면 기기가 샘플을 추출/실행하고 감지된 이벤트의 실시간 미리보기를 표시할 수 있습니다.
   7. 실시간 미리보기에서 형광 임계값(전압 및 게인)과 셀 크기를 조정하여 세포 파편을 제외하면서 원하는 세포 집단 주위에 게이트를 그립니다.
      메모: FSC는 크기에 따라 세포를 구별하는 데 도움이 되므로 사용자가 단핵구 및 림프구와 같은 면역 체계의 세포를 구별할 수 있습니다. 단핵구는 림프구에 비해 더 크고 더 높은 FSC 강도를 보여줍니다.
   8. 약 5,000개의 살아있는 MoDC, 50,000개의 살아있는 림프구, 50,000개의 살아있는 단핵구 이벤트를 획득합니다.
   9. negative control 샘플과 관련하여 모든 매개변수가 조정되면 Stop을 클릭하고 프로토콜을 저장합니다.
   10. 이제 모든 샘플을 다중 튜브 로더에 로드합니다. 작업 목록에서 각 샘플을 정의하고, negative control을 참조하여 조정된 파라미터를 실험 내의 모든 샘플에 적용합니다. Acquire 옵션을 클릭하여 실험의 모든 샘플을 연속적으로 실행할 수 있습니다.
   11. 모든 샘플의 데이터가 수집되면 순차적 이중 파라메트릭 및 모노 파라메트릭 히스토그램을 생성할 수 있는 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 저장하고 읽을 수 있는 데이터로 변환합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ACK 용해 버퍼	Gibco, 써모 피셔	A1049201	수확된 PBMC 분획에서 잔류 적혈구의 용해를 위한 Ammonium-Chloride-Potassium 완충액
소 수지상 세포 성장 키트	Bio-Rad, 영국	PBP015KZZ	재조합 소 IL-4 및 GMCSF로 구성된 사이토카인 칵테일
소 IFN-γ ELISA 키트	바이오 라드	MCA5638KZZ	배양 상층액에서 IFN-γ 발현을 측정하기 위한 키트 사용
노비박 광견병	MSD Animal Health, 영국		> 2 I.U./mL 광견병 바이러스 균주를 함유한 세포 배양 불활성화 백신 1μL/mL
광학 씰	Bi0-라드	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strip, 광학, ultraclear, qPCR 기계와 호환
인산염 완충액 식염수(PBS)	Gibco, 써모 피셔	10010023	pH 7.4, 1x 농도
FlowTubes/ FACS(Fluorescenceactivated single-cell sorting) 튜브	팔콘코닝	352235	5 mL, 스테리얼, 세포 여과기 스냅 캡이 있는 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 유세포 분석 분석에 사용
휴먼 CD14 마이크로비즈	Miltenyi Bioteck, 독일	Tel.: 130-050-201	PBMC에서 소 단핵구를 선택하는 데 사용되는 단클론 항-human CD14 항체 이소타입 IgG2a에 접합된 2mL 마이크로비드
정제된 항인간 Ki-67 항체	Biolegend, 미국	350501	단클론 항체, 암소와 교차 반응, 클론 ki-67
RPMI 1640 미디엄	시그마 알드리치	R8758	L-글루타민 및 중탄산나트륨을 이용한 세포 배양 배지
조직 배양 시험판 24	TPP, 스위스	92024	24웰 플레이트, 방사선 살균, 성장 강화 처리, 용량 3.18 mL