조혈낭에 대한 적세포 재부착을 평가하기 위한 Hemocyte Disturbance Assay

초록

출처: Petraki, S. et al., Assay Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.J. Vis. 특급(2015년)

이 비디오는 초파리 유충의 조혈 주머니에서 혈구 재접착을 평가하는 혈구 교란 분석을 보여줍니다. 기계적 교란은 상주 혈구를 방출하여 순환 혈구 수를 증가시킵니다. 회복 후, 상주 혈구의 재부착이 확인되어 가역성을 보여줍니다.

프로토콜

1. 혈구 출혈/긁힘 분석

1. 슬라이드 준비:
   1. 타일 스캐닝 기능이 없는 현미경에 대한 옵션 1: 분석할 각 유충에 대해 현미경의 시야 관찰 영역에 해당하는 각각 2mm 정사각형의 약 5개의 Pap-pen well이 있는 하나의 유리 슬라이드를 준비합니다. 각각에 약 5 - 10μl의 S2 매체를 추가합니다(그림 1A). 우물이 마르는 것을 방지하기 위해 슬라이드를 습한 챔버에 보관하십시오.
   2. 타일 스캐닝 기능이 있는 현미경에 대한 옵션 2: 분석할 각 유충에 대해 각각 ~3 - 4mm 정사각형의 3-4개의 Pap-pen well이 있는 하나의 유리 슬라이드를 준비합니다. 각 well에 약 15 - 20μl의 S2 매체를 추가합니다(그림 1B). 웰이 마르는 것을 방지하기 위해 슬라이드를 습한 챔버에 보관하십시오.
      메모: 위에서 권장하는 웰 수는 유충당 최대 3,000개의 혈구를 보유하기에 충분합니다(후기^2nd instar 유충, ~2.5 - 3mm 길이, 대부분의 유충 혈액 세포를 표지하는 이식유전자). 더 큰 혈구 수를 평가할 때 과밀을 피하기 위해 더 많은 우물이 필요할 수 있습니다.
2. 유충 수집:
   1. 유충이 들어있는 파리 유리병에 물을 뿌리고 유충을 페트리 접시에 씻어 넣거나 유충이 들어있는 음식을 페트리 접시에 떠서 물병을 사용하여 물로 희석하십시오.
   2. 붓을 사용하여 페트리 접시에서 유충을 부드럽게 골라 캐비티 접시의 물 속에 넣거나 차가운 블록의 슬라이드에 놓습니다.
      메모: 유충은 제한된 시간 동안 물이나 차가운 블록에 보관할 수 있습니다. 유충의 죽음이나 혈구에 대한 원치 않는 영향을 피하기 위해 45분 이내에 검체를 사용하십시오.
3. 해부:
   1. 차가운 금속 블록의 형광 현미경으로 유충을 선택합니다. 원하는 경우 크기와 이미지 유충을 측정합니다.
   2. 순환 혈구의 분리("Bleed"):
      1. 유충이 선택되면 첫 번째 Pap-pen well에 유충 한 마리를 놓습니다(그림 1C, 2A).
      2. 깨끗한 바늘 2개 또는 해부 가위와 집게를 사용하여 유충의 뒤쪽과 앞쪽 끝을 모두 절개합니다. 상주 혈구를 방해하지 않으려면 유충의 복부 쪽을 절개하는 것이 가장 좋습니다. 일관된 결과를 얻으려면 모든 유충에 대해 동일한 위치에 절개하십시오. 1^st instar 유충의 경우 1 절개 (복부 전방)로 충분합니다.
      3. 유충이 압력이나 신체적 동요 없이 몇 초 동안 피를 흘리도록 합니다(그림 2A).
         메모: 여러 유충에 대해 작업하는 경우 유충을 얼음에 너무 오래 두어 샘플의 무결성에 영향을 미치지 않도록 다음 단계로 진행하기 전에 각 유충에 대해 이러한 절개를 만드는 것이 좋습니다.
      4. 바늘이나 집게로 유충을 부드럽게 들어 올려 두 번째 우물에 담그고 남아 있는 순환 혈구를 헹굽니다. 그 후, 상주 혈구의 방출이 뒤따릅니다.
   3. 상주 혈구의 분리("Scrape"):
      1. 유충을 다음 우물로 부드럽게 옮깁니다(그림 2C).
      2. 일반적으로 유충의 앞쪽 끝에서 약 1/3 떨어진 곳에 위치하며 유충 체벽을 통해 등쪽으로 형광을 발할 수 있는 유충의 림프선을 확인합니다. 구멍이 뚫리지 않도록 림프선에 가능한 한 가깝게 바늘로 유충을 고정하여 상주 혈구를 방출하는 동안 림프선을 피하십시오(그림 2C).
         메모: 정상적인 발달 기간 동안에는 유충 혈구에 비해 림프선 혈구의 성숙이 지연되며, 분화된 혈구의 형광 보고자는 어린 유충의 림프선에서 신호를 보여주지 않을 수 있습니다. 이러한 경우, 림프선 혈구에 의한 분화된 형광 표지된 유충 혈구의 오염이 예상되지 않기 때문에 림프선에 대한 주의를 덜 기울일 필요가 있습니다.
      3. 긁어내거나 잽싸게 잽싸게 찔러대는 해부 과정에서 상주하는 혈액 세포를 방출합니다. 필요에 따라 하나의 바늘 끝을 사용하여 림프선(위 참조) 또는 다른 신체 부위 근처의 유충을 효과적으로 고정합니다. 다른 바늘을 사용하여 유충 체벽을 통해 보이는 혈구 클러스터를 잽싸게 찔러(그림 2C, E), 혈구를 분리하는 것을 목표로 합니다. 혈구는 긁는 동작으로 방출될 수도 있습니다. 그러나 표피를 조기에 찢으면 큰 혈액 세포 클러스터가 방출되어 자동 계수가 더 어려워질 수 있습니다.
         메모: 유충의 나이와 유전자형에 따라 총 혈구의 수는 달라집니다. 위에서 설명한 방출 과정을 여러 웰에 분산시켜 일부 웰에 혈액 세포가 과도하게 밀집되어 단일 세포 이미지 분석을 더 어렵게 만들 수 있는 것을 방지합니다.
      4. 최종 사체에 남아 있는 혈구가 거의 없는 경우, 현미경을 통한 관찰과 수동 집계 카운터를 사용하여 이러한 혈구를 계수합니다(그림 2E). 계수를 용이하게 하려면 동일한 슬라이드의 깨끗한 영역에 사체를 놓고 가능한 한 얇게 펴서 광학 평면의 수를 줄이십시오.
      5. 박리가 완료되면 웰을 이미징하기 전에 세포가 가라앉을 때까지(반드시 부착될 필요는 없음) 5-10분 정도 기다립니다. 건조를 피하기 위해 습한 챔버에서 슬라이드를 배양하고 침전된 혈구를 방해할 수 있는 슬라이드를 거칠게 다루지 마십시오.
         메모: 혈구 수를 측정할 때 방출된 세포는 고정되어 있지 않으며 세포는 해부 직후, 바람직하게는 유충에서 방출된 후 30분 이내에 이미지화해야 합니다. 배지의 부피와 세포 특성에 따라 대다수의 세포는 5 - 10분 이내에 침전될 것이며, 이는 웰에 있는 매체의 광학 평면을 통해 집중하여 확인해야 합니다. 그러나 이때까지 혈액 세포의 일부만 슬라이드 표면에 부착되었을 것이며, 이는 세포 고정 기반 접근 방식을 위해 이 프로토콜을 수정하는 경우 고려해야 할 사실입니다.
4. 부량:
   1. 형광 현미경으로 침전된 적혈구의 이미지를 촬영합니다(그림 2B, D, F). ImageJ 소프트웨어를 사용하여 혈구를 정량화합니다.
   2. ImageJ 셀 카운팅 알고리즘을 위한 이미지를 준비합니다.
      1. ImageJ: File → Open →(파일을 찾아 선택)을 사용하여 우물의 이미지를 엽니다.
      2. 이미지가 8비트 또는 16비트인지 확인합니다. Image(이미지)를 선택하여 이미지의 임계값을 조정한 다음 Adjust(조정)를 클릭하고 Threshold(임계값)를 선택합니다. "임계값 창"을 관찰합니다(그림 3A).
      3. "어두운 배경" 옵션을 확인하십시오. "빨간색"을 선택하고 이미지의 각 셀이 빨간색 점으로 표시될 때까지 하한 임계값 수준(검은색 화살표 참조)을 높입니다(덮이지 않는 셀은 회색조로 표시됨). 그림 3B). 하한 임계값이 증가하면 일부 셀이 표시되지 않게 됩니다. 이것은 하한 임계값을 얼마나 멀리 설정할지를 나타내는 지표가 될 수 있습니다.
         메모: 때때로 세포 클러스터는 분해될 수 없으며 입자 계수기에 의해 하나로 계산됩니다. 이러한 경우, 클러스터의 셀 수는 이미지를 검사하고(필요한 경우 확대) 집계 카운터를 사용하여 수동으로 계수하여 추정할 수 있습니다. 또는 세포 클러스터를 해결하기 위해 Lower Threshold를 높일 수 있습니다. 이 조작으로 인해 표시되지 않은 셀은 집계 카운터를 사용하여 계산할 수 있습니다.
   3. ImageJ를 사용하여 셀 수를 분석합니다.
      1. 입자 분석기를 실행하여 세포를 계수합니다(그림 3C). Analyze(분석)를 선택하고 Analyze Particle(입자 분석)을 클릭합니다. 선택적으로 "Overlay Outlines(오버레이 윤곽선)"를 선택하여 알고리즘이 계수하는 입자를 확인합니다(그림 3D). 또는 알고리즘이 계산할 단위(예: 셀, 셀 덩어리 등)의 크기 또는 픽셀 영역에 대한 제한을 설정합니다.
      2. 확인을 클릭합니다. 개수가 있는 요약 창을 관찰합니다(그림 3E).

2. 혈구 교란 분석

1. 혈구를 교란하려면 유충을 선택하여 약 0.5g의 유리 구슬(212 - 600 μm)이 있는 2ml 미세 원심분리 튜브에 넣고 0.5ml의 물을 추가합니다.
2. 1분 동안 10의 속도로 손으로 튜브를 소용돌이칩니다.
3. 마이크로 원심분리기 튜브의 내용물을 페트리 접시에 쏟고 붓으로 유충을 골라내어 유리 구슬에서 유충을 회수합니다.
4. 회복 단계에서는 미리 준비한 페트리 접시에 유충을 소량의 파리 먹이와 함께 놓습니다. 유충이 45분 동안 또는 원하는 대로 혈구 패턴을 다시 설정할 수 있도록 합니다.
   메모: 움직임을 멈춘 유충은 그 과정에서 죽었으므로 버리십시오. 그러나 일반적으로 소용돌이 1분 후에는 거의 손상을 볼 수 없습니다.
5. 회수 기간이 지나면 위의 섹션 1에 설명된 대로 Bleed/Scrape Assay를 계속합니다.

결과

그림 1. Hemocyte Bleed/Scrape and Disturbance Assay 설정 및 회로도. (가)단일 이미지 슬라이드 설정: 5X 대물렌즈로 이미징하기 위한 5개의 2mm 정사각형.(B) 타일 스캔 슬라이드 설정: 타일 스캔 현미경으로 ≤2.5mm 유충의 출혈/긁힌 자국을 이미징하기 위한 4개의 3mm 정사각형. 이미징에 권장되는 대물렌즈는 5X 또는 10X입니다. (C) ImageJ를 사용한 Bleed/Scrape Assay 도식 및 결과 정량화. (D) Disturbance Assay에서 혈구 패턴은 유리 구슬로 유충을 소용돌이치게 하여 기계적으로 파괴됩니다. 유충은 45분 동안 회복할 수 있으며, 그 동안 혈...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6cm/9cm 페트리 접시			평가할 각 유전자형에 대해 하나씩
물 분출 병
금속 숟가락/주걱
얇은 붓			예: "라이너"
유리 캐비티 접시
PAP 펜: 슈퍼 PAP PEN IM3580	벡크만 쿨터
유리 슬라이드			각 슬라이드에는 5개 이상의 PAP PEN 사각형이 그려져 있습니다. 사각형의 크기는 이미징 대물렌즈와 현미경 카메라의 배율에 따라 다릅니다. 예: 2mm 정사각형.
촉촉한 챔버			이것은 슬라이드와 우물이 마르는 것을 방지하는 데 사용됩니다 : 젖은 종이 타월이 달린 밀봉 된 용기가 측면 / 바닥을 감싸고 있습니다
슈나이더의 초파리 세포 배양 배지	인비트로젠
콜드 블록			이것은 얼음이 들어있는 양동이에 식힌 금속 블록 (일명 가열 블록)입니다.바람직하게는 검은 색 또는 다른 어둡고 반사되지 않는 색상이 바람직합니다
바늘이 있는 1ml 주사기 2개(27G 1/2)	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)		해부용.
선택 사항: 수술용 스프링 가위(절삭날 2mm)	정밀 과학 도구
유리 구슬, 212-600 미크론	시그마
2 ml Eppendorf 튜브	에펜도르프		유전자형 평가당 1회
와류 믹서	피셔 사이언티픽
형광으로 표시된 혈구를 가진 형질전환 초파리 유충. 적합한 전이유전자는 다음과 같다: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP 및 -GFP (Gajewski et al., 2007), 또는 HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), 또는 UAS-GFP 또는 다른 형광 단백질 전이유전자와 결합된 eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009).
형광 해부 현미경	라이카		여기: 라이카 M205, 카메라, 이미징 소프트웨어 및 측정 모듈 옵션
카메라가 부착된 도립 형광 현미경	Leica 또는 Keyence		타일 스캔 기능의 유무에 관계없이(예: 라이카 DMI 시리즈, Keyence BIOREVO BZ-9000 시리즈)

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