SIV 특이적 CD8+ 기억 T 세포를 분석하기 위한 펩타이드-MHC-I 테트라머 염색 기법

초록

출처: Gonzalez-Nieto, L., et al. 펩타이드-MHC-I 테트라머 염색에 의한 붉은털 원숭이의 원숭이 면역결핍 바이러스 특이적 CD8⁺ T 세포 분석. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 펩타이드 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(pMHC-I) 사량체를 사용하여 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)에 특이적인 CD8⁺ 메모리 T 세포를 특성화하는 방법을 보여줍니다. pMHC-I 사량체는 SIV 특이적 펩타이드에 결합하고 형광단에 접합된 4개의 MHC-I 분자의 복합체입니다. 이러한 사량체는 SIV 특이적 CD8⁺ T 세포의 T 세포 수용체(TCR)에 선택적으로 결합하여 이러한 세포의 특성화를 용이하게 합니다.

프로토콜

1. PKI 처리

참고: 이것은 선택 사항이지만 Mamu-B*017:01 사합체에 권장됩니다.

1. PBMC를 R10 배지에 1.6 x 10⁷ cells/ml의 농도로 재현탁합니다.
2. 이 세포 현탁액 50 μl를 해당 유세포 분석 튜브에 추가합니다. 각 튜브에 50μl의 100nM PKI 용액을 추가합니다.
3. 각 튜브를 소용돌이치십시오. 37 °C에서 30 분 동안 배양합니다. 이 단계가 끝날 때까지 각 튜브에는 8.0 x 10⁵ PBMC 및 50 nM의 PKI를 포함하는 100 μl의 세포 현탁액이 있어야 합니다.
4. pMHC-I 테트라머 염색 단계를 진행합니다.

2. 형광 표지 pMHC-I 테트라 머로 염색

1. pMHC-I 테트라머 마스터 믹스를 준비하기 전에 20,000 x g에서 pMHC-I 테트라머 튜브를 4°C에서 최소 15분 동안 원심분리합니다. 이 단계의 목표는 배경 염색을 증가시킬 수 있는 pMHC-I 사합체 용액에서 단백질 응집체를 펠릿화하는 것입니다. 원심분리 단계가 완료되면 단백질 응집체가 축적될 튜브 바닥에서 피펫팅을 하지 마십시오.
2. 모든 실험용 튜브를 염색하기에 충분한 pMHC-I tetramer 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 이 마스터 믹스의 총 부피의 15%를 초과하여 준비합니다.
3. pMHC-I 사량체를 염색 완충액(예: Brilliant Stain Buffer)에 희석하여 각 검사에 25μl의 pMHC-I 사량체 마스터 믹스를 첨가합니다.
   1. 테스트당 2개의 pMHC-I 사량체로 PBMC를 라벨링합니다. 하나는 알로피코시아닌(APC)에 접합되고 다른 하나는 BV(Brilliant Violet) 421에 접합됩니다.
4. 8.0 x 10⁵ PBMC를 해당 유세포 분석 튜브에 최종 부피 100 μl로 추가합니다. 세포가 위에서 설명한 PKI 처리를 받은 경우 이 단계에서 이미 100μl에 재현탁되어야 합니다.
5. 25 μl의 pMHC-I tetramer 마스터 믹스를 해당 유세포 분석 튜브에 추가합니다. 이 단계가 끝날 때까지 각 튜브의 최종 부피는 125μl가 되어야 합니다.
6. 세포 현탁액을 균질화하기 위해 각 튜브를 소용돌이치게 합니다.
7. 실온의 어두운 곳에서 45분 동안 배양합니다. 이 45분 배양 동안 표면 염색 단클론 항체(mAb) 칵테일을 준비합니다.

3. 표면 염색

1. 모든 실험용 튜브를 염색할 수 있을 만큼 충분한 mAb 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 이 마스터 믹스의 총 부피의 15%를 초과하여 준비합니다.
2. 테스트당 50μl가 추가되도록 염색 버퍼가 있는 마스터 믹스의 부피를 조정합니다.
3. 비 CD8⁺ T 세포의 적절한 배제 및 메모리 하위 집합의 묘사를 위해 표면 염색 마스터 믹스에서 다음 분자에 대한 적정량의 mAb를 사용하십시오.
   메모: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 및 CCR7 FITC 등 각 mAb에 접합된 형광 색소를 참조로 제공합니다. CD14, CD16 및 CD20에 대한 mAb는 "dump" 게이트에 포함되기 때문에 동일한 형광 색소(즉, BV 510)에 접합됩니다.
4. 표면 염색 마스터 믹스[즉, 아민 반응성 염료(ARD)]에서 죽은 세포를 구별하기 위한 고정성 염료를 포함합니다. ARD 시약이 "덤프" 게이트에 사용된 것과 유사한 방출 스펙트럼을 가진 형광 색소에 접합되어 있는지 확인하십시오. 이 경우 ARD Aqua를 사용하십시오.
5. 3.1-3.4에 설명된 염색 마스터 믹스 50 μl를 해당 유세포 분석 튜브에 추가합니다. 이 단계가 끝날 때까지 각 튜브의 최종 부피는 175μl가 되어야 합니다.
6. 각 튜브를 소용돌이치십시오. 실온에서 25분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
7. 세척 완충액(소 혈청 알부민 0.1% 및 0.45g/L NaN3을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS) 용액)으로 세포를 세척합니다.
   주의: 아지드화나트륨(NaN₃)은 독성 물질입니다. 아주 적은 양이라도 노출되면 증상이 나타날 수 있습니다. 이러한 실험이 수행되는 기관의 EHS(Environmental Health and Safety) 사무소에서 지정한 지침에 따라 이 물질을 취급하십시오.
8. 510 x g에서 5분 동안 원심분리기 튜브를 사용합니다. 상층액을 별도의 폐기물 용기에 조심스럽게 디캔팅합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
   주의: 표백제가 들어있는 저장고에 상등액을 세척하면 세척 완충액에 존재하는 아지드화나트륨과 반응하여 독성 가스가 형성될 수 있으므로 세척 완충액을 디캔트하지 마십시오. 이러한 실험이 수행되고 있는 기관의 EHS 사무실에 아지드화나트륨 폐기 방법에 대한 지침은 문의하십시오.
9. 디캔팅 후, 각 튜브에 남아 있는 남은 액체의 세포를 와류로 가열합니다.

4. 세포 고정

1. 250μl의 2% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 모든 튜브에 추가하여 세포를 고정합니다.
   주의: PFA는 독성 물질입니다. 아주 적은 양이라도 노출되면 증상이 나타날 수 있습니다. 이러한 실험이 수행되는 기관의 EHS 사무실에서 지정한 지침에 따라 이 물질을 취급하십시오.
   1. 2% PFA 용액은 세포에 등장성이어야 하므로 PBS를 사용하여 이 용액을 준비합니다. 2% PFA 용액 100밀리리터는 여러 실험에 충분합니다. 세포 응집체의 형성을 방지하기 위해 2% PFA를 첨가한 직후 모든 튜브를 완전히 와류로 회전시킵니다.
2. 4 °C의 어둠 속에서 20 분 동안 배양하십시오.
3. 3.7-3.9단계를 반복하여 셀을 세척합니다. 이 단계가 완료되면 세포를 4°C의 어두운 곳에서 24-48시간 동안 보관할 수 있습니다. 투과화 단계로 진행하기 전에 튜브를 철저히 와류
화하십시오.

5. 세포의 투과화

1. 투과화 완충액 500μl를 추가합니다. 모든 튜브를 소용돌이치십시오.
2. 실온에서 10분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
3. 3.7-3.9단계를 반복하여 셀을 세척합니다.

6. 세포 내 염색

1. 모든 실험용 튜브를 염색할 수 있을 만큼 충분한 mAb 마스터 믹스를 준비합니다.
2. PBS 또는 염색 완충액으로 부피를 조정하여 검사당 50μl의 세포 내 mAb 마스터 믹스가 추가되도록 합니다.
3. CD3 및 그랜자임 B(Gzm B)에 대한 적정 양의 mAb를 사용하여 6.1 및 6.2에 설명된 mAb 마스터 믹스를 준비합니다.
   메모: pMHC-I tetramers에 의한 TCR 결합은 CD3 내재화를 초래할 수 있으며, 이는 anti-CD3 mAb가 표면 염색 마스터 믹스에 첨가될 경우 tetramer + CD3⁺ CD8⁺ T cell의 검출을 방해할 수 있습니다. 이를 방지하려면 이 단계, 즉 세포가 투과화된 후에 anti-CD3 mAb를 첨가하십시오. 각 mAb에 접합된 형광 색소는 CD3 PerCP Cy5.5 및 Gzm B PE를 기준으로 합니다.
4. 해당 튜브에 mAb 칵테일 50μl를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
5. 3.7-3.9단계를 반복하여 셀을 세척합니다. 튜브는 유세포 분석기에서 획득할 준비가 되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
다사티닙	축삭 메드켐	축삭 1392	DMSO에 재현탁하고 즉시 -20°C에서 보관해야 합니다.
RPMI w/ 글루타맥스	gibco/ 생명 기술	61870-036	4°C에서 보관해야 합니다.
열 비활성화 FBS	gibco/ 생명 기술	제10082-147	4°C에서 보관해야 합니다.
페니실린-스트렙토마이신프-암포테리신 B	론자	17-745E	4°C에서 보관해야 합니다.
DMSO, 무수	생명 기술	D12345	실온에서 보관하십시오.
5mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브	폭스바겐	60819-728
플루오로크롬 접합 pMHC-I 테트라머	NIH Tetramer Core 또는 MBL, Inc.		4°C에서 보관 및 유지 관리해야 합니다. 사용하기 전에 20,000 x g의 원심분리기를 15분 동안 사용하십시오. 얼리지 마십시오.
형광색소 접합 mAbs	다양한 회사		4°C에서 보관 및 유지 관리해야 합니다. 얼리지 마십시오.
LIVE/DEAD 고정식 아쿠아 데드 셀 스테인 키트	생명 기술	엘34957	-20°C에서 보관해야 합니다. 사용하기 전에 각 부분 표본을 50μL의 DMSO에 재현탁합니다.
브릴리언트 스테인 버퍼	BD 바이오사이언스	563794	4°C에서 보관해야 합니다.
인산염 완충 식염수	폭스바겐	97064-158	실온에서 보관
알부민 소	폭스바겐	700011-230	4°C에서 보관해야 합니다.
아지드화나트륨	폭스바겐	97064-646	실온에서 보관하십시오. 독성 물질. 표백제와 혼합하지 마십시오.
바래다	폭스바겐	89501-620	부식성 화학 물질은 아지드 화나트륨과 혼합 할 수 없습니다. 조심히 다루세요
파라포름알데히드	전자 현미경 과학	15714-S	가연성, 부식성 및 독성 시약. 조심히 다루세요
폴리소르베이트 20 (트윈-20)	알파 에자르	L15029	실온에서 보관
투과화 솔루션 2	BD 바이오사이언스	340973	독성 및 부식성 시약. 조심히 다루세요
Sarsdet 튜브 1.5mL 스크류 탑	폭스바겐	72.692.005
2.0ml DNA/RNA 낮은 바인딩 튜브	에펜도르프	22431048	멸균 마이크로튜브의 사용이 선호됩니다.
와류 믹서
생물안전성 캐비닛
Milli Q Intergral 정수 시스템	EMD 밀리포어	ZRXQ010WW	모든 공급자의 분자 생물학 등급의 물을 사용할 수 있습니다
마이크로 원심분리기
원심 분리기
4 °C 냉장고
BD LSR II	BD 바이오사이언스		유세포 분석기에는 사용된 염색 패널과 호환되는 레이저와 필터가 포함되어야 합니다.
탈이온수
알루미늄 호일	VWR 사이언티픽 INC.	89068-738
부 화기			내부 온도를 37°C로 유지할 수 있어야 합니다.
FACS 디바 소프트웨어	BD 바이오사이언스
Flowjo 소프트웨어 버전 9.6	플로우조		FACS Diva 소프트웨어에서 생성된 FCS 파일을 분석하는 데 사용됩니다
마이크로피펫 팁

호 년 년 . .