백혈구와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위한 층류 기반 분석

초록

출처: Vajen, T., et al. 배양된 혈관 세포 및 부착 혈소판에 대한 백혈구 동원을 조사하기 위한 층류 기반 분석. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 백혈구와 내피 세포와 같은 세포 파트너의 상호 작용을 특성화하기 위한 층류 기반 분석을 보여줍니다. 이 방법은 혈관 세포의 손상되지 않고 합류하는 층에 관류될 때 백혈구의 접착, 데데젼 및 전이에 대한 동적 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

>1. 백혈구의 형광 표지 및 관류(인간의 경우 PMN 또는 THP-1, 쥐 유동 기반 분석의 경우 RAW264.7 또는 1차 마우스 단핵구)

1. 형광 라벨링
   1. 백혈구(1 x 10⁶/mL)에 세포 투과성 녹색 형광 핵산 염색(1μM)을 표시합니다. 37°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
   2. 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 PBS로 세포를 세척하고 분석 버퍼에서 0.5 x 10⁶ cells/mL(테스트 조건당 5mL, 유속에 따라 다름)의 농도로 세포를 현탁합니다.
2. 플로우 챔버 분석 준비
   1. 세포 단층에 백혈구 부착을 위해 접시에서 세포 배양 배지를 버리고 flow chamber에 조립합니다. 튜브를 주사기에 연결합니다. 고정된 혈소판에 백혈구 접착을 위해 마이크로 슬라이드를 주사기에 연결합니다. 수조를 37°C로 예열합니다.
   2. 관류 주사기(50mL)를 사용하여 주사기 홀더에 주사기를 설치하고 펌프를 회수 모드로 설정합니다. 펌프 부피를 0mL로 설정하고 50mL 주사기의 직경을 26.70mm로 설정합니다.
   3. 엘보우 루어 커넥터를 튜브의 한쪽 끝에 연결합니다. 루어 락 커플러를 주사기에 놓고 엘보우 루어 커넥터가 있는 튜브를 루어 락 커플러에 연결합니다. 자유 튜빙 끝을 흐름 챔버에 연결합니다.
3. 백혈구 관류 및 접착
   1. 세포 단층에 백혈구 부착을 위해 접시에서 세포 배양 배지를 버리고 flow chamber에 조립합니다. 튜브를 주사기에 연결합니다. 고정된 혈소판에 백혈구 접착을 위해 마이크로 슬라이드를 주사기에 연결합니다.
   혈관 또는
   2. 혈소판 단층에 대한 백혈구 관류 및 접착을 위해 두 번째 튜브를 분석 버퍼가 포함된 50mL 원추형 튜브에 넣고 튜브에 1mL 피펫을 채운 다음 튜브를 짜서 흐름 챔버에 연결합니다.
   3. 백혈구 관류 전에 세포 현탁액에 3mM CaCl₂ 및 2mM MgCl₂를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 세포를 관류하기 전에 분석 완충액을 관류하여 챔버와 튜브에서 가능한 공기를 제거합니다.
   5. 튜브 끝을 단단히 조이고 튜브를 분석 버퍼에서 세포 현탁액으로 전환하여 기포가 갇히는 것을 방지하여 튜브 끝을 닫습니다. 첫 번째 세포가 도착할 때까지 적절한 유속/전단 응력으로 세포를 관류합니다.
   6. 적절한 유속/전단 응력으로 2분 동안 세포를 관류하고, 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라에 연결된 100X 배율을 사용하여 반전 위상차/형광 현미경(예: EVOS-FL)으로 2-6분 사이에 롤링 및 부착 세포의 사진을 6장 이상 캡처합니다.
      참고: 유속/전단 응력은 유동 챔버 치수와 관류액의 점도에 따라 달라집니다. 여기에 사용된 관류 챔버의 경우(재료 표 참조):
      τ=η*97.1*Φ
      τ: 전단 응력 (1 dyn/cm²)
      η : 점도 (0.015 dyn * s / cm²)
      Φ: 유속(0.67mL/분)
4. 백혈구 접착 제거
   1. 접착 제거를 위해 튜브를 짜서 세포 현탁액에서 분석 버퍼로 튜브를 전환하여 기포가 갇히는 것을 방지하십시오.
   2. 적절한 유속/전단 응력을 가진 분석 버퍼를 사용한 관류를 통해 세포를 분리합니다(3.3.7 참고 참조).
5. 백혈구 형질전환
   1. 백혈구 형질전환의 경우, 적절한 양의 백혈구가 부착될 때까지(~50 cells/view field) 백혈구를 관류합니다(3단계).
   2. 백혈구 현탁액을 분석 완충액으로 교체합니다.
   3. 37°C에서 30-60분 동안 10-15초마다 타임 랩스로 형질전환 세포를 기록합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
도립 형광 현미경(예: EVOS-FL	생명 기술 유럽 BV
펌프 예: 모델: 210-CE	세계적인 정밀 기기	78-9210W
Falcon 35mm TC 처리된 EasyGrip 스타일 세포 배양 접시	코 닝	353001
50 mL 주사기	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	300137
실리콘 튜빙	폭스바겐	Tel.: 228-0700
팔꿈치 Luer 커넥터 남성	이비디	10802
여성 Luer Lock 커플러	이비디	10823
플로우 챔버	RWTH 아헨 대학병원	특허 DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitroUntersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005년.
콜라겐 유형 I, 쥐 꼬리	생명 기술 유럽 BV	A1048301
재조합 인간 TNF-α	페프로텍	300-01ᅡ
펩타이드 6용 트롬빈 수용체 활성제 (TRAP - 6)	아나스펙 / 유로젠텍	24191
SYTO 13 녹색 형광 핵산 염색제	생명 기술 유럽 BV	S7575
염화칼슘 이수화물	머 크	102382
염화마그네슘 육수화물	시그마-알드리치 케미	M2670
마우스 단핵구/대식세포 RAW264.7	증권 시세	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 고혈당	지브코	11965092