단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 이미징

초록

출처: Raghu, D. et al., 단일 세포 분비물의 시공간 이미징을 위한 무표지 기술. J. Vis. 특급.(2015년)

이 비디오는 단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 영상을 보여줍니다. 미세유체 설정과 펩타이드 결합 플라즈몬 나노구조 칩을 사용하여 공명 각도에서 반사광 강도의 변화는 단일 세포에서 분비된 단백질과의 상호 작용을 보여줍니다.

프로토콜

1. 나노 구조 제작

1. 나노 가공을 위한 기판으로 두께가 약 170μm(No. 1.5)인 직경 25mm의 유리 커버슬립을 선택하십시오.
2. 커버슬립을 피라냐 용액(황산과 과산화수소의 3:1 비율)에 최소 6시간 동안 담그고 피라냐에 적신 커버슬립을 초순수 18.2MΩ 탈이온수(DDW)로 다량의 세척합니다.
   주의: 피라냐 산은 유기 물질과 격렬하게 반응하므로 극도의 주의를 기울여 다루어야 합니다.
3. 나노 구조의 패터닝 및 이미징 중 전하 효과를 피하기 위해 전자빔 증발에 의해 커버슬립에 10nm 크롬 박막을 증착합니다.
4. 에틸 락테이트 메틸 메타크릴레이트(MMA_EL6) 공중합체로 구성된 이중층 레지스트의 첫 번째 층을 2,000rpm에서 45초 동안 회전한 다음 150°C에서 굽습니다.폴리메틸 메타크릴레이트(950PMMA_A2)의 두 번째 층을 3,000rpm에서 45초 동안 회전한 다음 180°C에서 굽습니다.
5. 300 μC/cm²의 면적 선량으로 25 kV에서 전자빔 리소그래피(EBL)를 사용하여 이중층 레지스트를 패턴화합니다. 이소프로필 알코올(IPA)/메틸 이소부틸 케톤(MIBK)에서 현상: 2/1 및 IPA로....

결과

그림 1.광학 설정.할로겐 램프에서 발광된 조명은 먼저 장역 통과 필터(LP)에 의해 필터링됩니다. 이 광은 선형 편광(P1)이며 40X/1.4 NA 대물렌즈를 통해 샘플을 비춥니다. 산란된 빛은 대물렌즈에 의해 수집되어 교차 편광판(P2)을 통과합니다. 50/50 빔 스플리터(BS)는 동시 분광 및 이미지 분석을 위해 수집된 광 경로에 삽입됩니다. 오른쪽 상단: 300nm의 피치로 분리된 9개의 개별 나노 구조의 원자력 현미경 이미지.

....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25mm 직경의 유리 커버 슬립	생명과학 도구	CSHP-No1.5-25	170±5μm가 최적입니다.
폴리 메틸 메타크릴레이트	마이크로켐	PMMA 950 A4
에틸 락테이트 메틸 메타크릴레이트	마이크로켐	MMA 엘6
전자빔 증발기	테메스칼	FC-2000
전자빔 리소그래피	레이스	150 시리즈
에탄올	시그마-알드리치	459836
아세톤	시그마-알드리치	320110
CR-7 크롬 에칭액	시안텍	CR-7
주사 전자 현미경	자이스	울트라 55
원자력 현미경	비코	나노스코프 III
플라즈마 애싱 시스템	기술	85 RIE 시리즈
SH- (CH2) 8-EG3-OH (SPO)	프로키미아	토륨 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH(SPC)	프로키미아	토륨 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2(SPN)	프로키미아	토륨 002-m11.n3-0.2
표면 플라즈몬 공명 시스템	비오라드	엑스퍼36
베어 골드 칩	비오라드	GLC 칩	단층을 제거하기 위해 플라즈마를 재화했습니다.
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드	열	22980
N-하이드록시숙신이미드(NHS)	열	24510
펜틸아민-비오틴	열	21345
에탄올아민	시그마-알드리치	E9508
뉴트라아비딘	열	31000
인산염 완충 식염수	열	28374
트윈 20	시그마-알드리치	P2287
도립 현미경	자이스	악시오 옵저버	현미경에는 40X 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착되어 있습니다. Pecon GmbH의 CO2 및 습도 배양
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