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1. 나노 구조 제작
- 나노 가공을 위한 기판으로 두께가 약 170μm(No. 1.5)인 직경 25mm의 유리 커버슬립을 선택하십시오.
- 커버슬립을 피라냐 용액(황산과 과산화수소의 3:1 비율)에 최소 6시간 동안 담그고 피라냐에 적신 커버슬립을 초순수 18.2MΩ 탈이온수(DDW)로 다량의 세척합니다.
주의: 피라냐 산은 유기 물질과 격렬하게 반응하므로 극도의 주의를 기울여 다루어야 합니다.
- 나노 구조의 패터닝 및 이미징 중 전하 효과를 피하기 위해 전자빔 증발에 의해 커버슬립에 10nm 크롬 박막을 증착합니다.
- 에틸 락테이트 메틸 메타크릴레이트(MMA_EL6) 공중합체로 구성된 이중층 레지스트의 첫 번째 층을 2,000rpm에서 45초 동안 회전한 다음 150°C에서 굽습니다.폴리메틸 메타크릴레이트(950PMMA_A2)의 두 번째 층을 3,000rpm에서 45초 동안 회전한 다음 180°C에서 굽습니다.
- 300 μC/cm2의 면적 선량으로 25 kV에서 전자빔 리소그래피(EBL)를 사용하여 이중층 레지스트를 패턴화합니다. 이소프로필 알코올(IPA)/메틸 이소부틸 케톤(MIBK)에서 현상: 2/1 및 IPA로 헹굽니다.
- 전자빔 증발기를 사용하여 기판에 Ti(5nm)/Au(80nm) 필름을 증착합니다.
- 금 증착 후 기판을 아세톤에 4시간 동안 담궈 공중합체 이중층 레지스트를 들어 올립니다.
- 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 기판을 검사하여 나노구조체의 형상과 크기를 확인하고, CR-7 에칭액을 사용하여 RT에서 60초간 습식 식각을 통해 기판에 남아 있는 크롬을 제거한 후 DDW로 헹굽니다.
- 33μm의 중심 간 어레이 간격을 설계하여 어레이 간 세포 이미징을 위한 공간을 확보합니다. 전자빔 라이터를 사용하여 300nm의 피치로 각 어레이에 대해 20 x 20 패턴으로 나노 구조를 패턴화합니다. 각 칩에는 높이 80±2.5nm, 직경 70±2.5nm의 일반적인 나노 구조 치수를 가진 300개의 어레이가 포함되어 있습니다.
- 크기와 균일성을 검증하기 위해 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 어레이의 하위 집합을 검사합니다.
- UV 경화 에폭시를 사용하여 커버슬립 뒷면에 지지 링(일반적으로 실리콘)을 부착합니다.
2. 자체 조립 단층의 칩 세척 및 적용
- 칩을 세척하고 재생하기 위해 동일한 조건에서 5분 동안 챔버를 세척한 후 45% 수소와 95% 아르곤의 300mTorr 혼합물에서 40W의 출력으로 플라즈마 회를 45초 동안
가열합니다.
- SH-(CH2)8-EG 3-OH(SPO)의 3:1 비율과 아민 또는 카르복실 작용기, 즉 SH-(CH2)11-EG 3-NH2(SPN) 또는 SH-(CH2)11-EG 3-COOH(SPC)의 3:1 비율로 구성된 2액형 에탄올 티올 용액에 칩을 담궈 플라즈마 애싱 직후 금 나노 구조를 기능화합니다.
- 칩을 티올 용액 O/N에 그대로 두어 자체 조립 단층(SAM)을 형성합니다.
- 칩을 에탄올로 헹구고 질소 가스로 건조시킵니다.
- 필요한 경우 기능화된 칩을 4°C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
- 사용할 준비가 되면 선택한 리간드에 따라 화학적 반응을 사용하여 SPN 또는 SPC 구성 요소를 리간드와 반응시킵니다(아래 참조).
메모: 칩은 수십 번 재생되고 재기능화될 수 있습니다. 주어진 칩은 6개월에서 1년 이상의 기간 동안 사용할 수 있습니다. 주어진 어레이에서 측정된 스펙트럼은 플라즈마 애싱(plasma ashing)에 의한 반복 재생과 생체 기능화(biofunctionalization) 후에 안정적으로 재생됩니다.
3. 표면 기능화 및 운동 특성화
참고: 상용 SPR 기기의 기능화된 칩을 사용하여 리간드와 분석물 사이의 운동 속도 상수를 특성화하고 비특이적 결합에 대한 SAM의 내성을 연구합니다. 효율적인 표면 기능화를 가능하게 하는 광범위한 유속과 미세유체 설계가 있습니다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 SPR을 보유하고 있기 때문에 권장 유량을 중심으로 표준화했습니다. 이러한 유속은 모든 SPR 기기의 일반적이므로 제한적이지 않습니다. SPR 기기는 모든 기능화가 LSPR(Localized Surface Plasmon Resonance Imaging) 칩에서 직접 수행될 수 있기 때문에 필수는 아니지만, LSPR 미세유체 설정이 그렇지 않은 반면 다중화 기기이기 때문에 작업량을 줄였습니다.
- 섹션 2에 설명된 대로 SAM으로 상업용 베어 골드 칩을 기능화합니다.
- SPC 기반 SAM을 사용하는 경우 DDW에서 133mM의 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)와 33mM의 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 1:1 혼합물로 10분 동안 카르복실기를 활성화합니다.
- 30μl/min의 유속을 사용하여 활성화된 카르복실기를 관심 항체/리간드와 300초 동안 접합합니다. 일반적으로 pH 6 인산염 완충액에서 리간드를 준비하지만 이는 분자에 따라 다를 수 있습니다.
- 리간드 접합 후 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.1M 에탄올아민을 30μl/분의 속도로 300초 동안 비활성화 단계로 유동시킵니다. 에탄올아민은 비특이적 결합을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
- 다양한 농도를 사용하여 100μl/min의 유속으로 관심 분석물을 주입하고 역학 분석 소프트웨어를 사용하여 운동 속도 상수를 계산합니다.
- 비특이적 결합에 문제가 있는 경우 SPC 또는 SPN에 대한 SPO의 비율을 늘립니다.
4. LSPR 일반 설정
- 현미경 설정:
- 100W 할로겐 램프를 사용하여 Koehler가 샘플을 조명합니다. 광 경로에 장역 통과 필터(일반적으로 593nm cutoff)를 사용하여 공진 이동에 기여하지 않는 파장을 제거합니다(그림 1).
- LSPRi 데이터 수집을 위해 40X 오일 이멀젼 대물렌즈(1.4 NA)와 열전기 냉각 16비트 CCD 카메라가 있는 도립 현미경을 사용하십시오.
- 현미경의 출력 포트에 빔 스플리터를 배치하여 이미지와 스펙트럼을 동시에 얻습니다.
- 온도 제어 현미경 스테이지를 37°C로 설정하고 4시간 동안 평형을 이룹니다.
- 현미경에 추가 배양 어셈블리를 통합하여 CO2 농도와 습도를 각각 5% 및 95%로 조절합니다.
- 칩 준비 및 장착:
- SPR 실험에서 결정된 최적의 2-8성분 SAM 비율로 섹션 2에 설명된 대로 LSPR 칩을 기능화합니다.
- 다음과 같이 맞춤형 미세유체 홀더에 칩을 로드합니다. 알루미늄 바닥 조각에 칩을 놓습니다. 이 바닥 조각과 실리콘 개스킷 및 투명한 플라스틱 상단 조각 사이에 칩을 끼웁니다. 나사 4개를 사용하여 clamp 어셈블리.
- 일반적인 SPC 기반 티올 응용 분야의 경우 DDW에서 133mM의 EDC와 33mM의 NHS를 1:1로 혼합하여 SPC 티올 성분의 카르복실기를 활성화하기 위해 300μl를 드롭 코팅합니다.
- 10분 동안 기다렸다가 10mM PBS로 표면을 수동으로 헹굽니다.
- 활성화된 카르복실기를 300μl의 리간드 용액을 드롭 코팅하여 관심 리간드(일반적으로 항체 또는 항체 단편)와 접합합니다.
- 30분 동안 기다렸다가 10mM PBS로 수동으로 헹굽니다.
- 비특이적 결합을 최소화하기 위해 칩의 PBS에 300μl의 0.1M 에탄올아민을 드롭 코팅합니다. 10분 동안 기다립니다.
- 에탄올 아민을 0.005 % Tween 20 (PBS-T20)을 함유 한 PBS로 세척한다.
- 칩 위에 석영 조각을 놓아 반월판 변화와 관련된 데이터의 변동을 줄입니다.
- 현미경에 장착하는 동안 PBS-T20 버퍼로 칩을 젖은 상태로 유지하십시오.
- LSPR 칩 어셈블리를 가열된 스테이지 샘플 홀더에 단단히 놓고 미세유체 튜브를 부착합니다.
- 안정된 상태에 도달할 때까지 microfluidics 튜브를 어셈블리와 플로우 버퍼(또는 세포 연구를 위한 무혈청 배지)에 부착합니다.
- 어셈블리와 현미경이 최소 2시간 동안 평형을 이루도록 합니다.
- 조이스틱을 사용하여 칩을 정렬하여 중앙 어레이가 분광학을 위한 광섬유와 정렬되도록 합니다. 분광 데이터는 분광계와 스펙트럼 분석 소프트웨어를 사용하여 가져옵니다.
- 소프트웨어 자동 초점, Zeiss Definite Focus 또는 이에 상응하는 자동 초점 장치를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 배열의 초점을 유지합니다.
5. 9E10 하이브리도마 세포에서 anti-c-myc 분비물의 LSPR 이미징
참고: 이 연구에 사용된 하이브리도마 세포주는 항-c-myc 항체를 구조적으로 발현하므로 화학적 유발 물질이 필요하지 않습니다
- c-myc 펩타이드로 나노 구조를 기능화합니다. 이는 클론 9E10 하이브리도마 세포에 의해 분비되는 항-c-myc 항체에 대해 1.77nM의 KD 값을 갖습니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제가 포함된 완전 성장 배지에서 5% CO2 미만의 37°C에서 T75 플라스크에 하이브리도마 세포를 배양합니다. 4 ×105 cells/ml의 셀 밀도를 유지합니다.
- 세포 분비 연구를 위해 T75 플라스크에서 원심분리로 펠릿 세포를 추출하고 RPMI-1640 무혈청 배지(SFM)로 두 번 세척하여 분비된 항체를 제거하고 세포 밀도를 4 ×106 cells/ml로 조정합니다.
- 세포를 채취하고 LSPR 칩에 도입하기 전에 생존력을 테스트합니다.
- 50μl의 세포 용액을 마이크로피펫으로 LSPR 칩에 수동으로 주입합니다. 몇 분 후 25-50개의 셀이 LSPR 칩의 표면에 부착됩니다.
- 미세유체 관류 시스템을 사용하여 새로운 SFM으로 용액에 남아 있는 세포를 씻어냅니다.
- 10μm 이내의 가까운 이미징을 위한 LSPR 어레이를 선택하지만 셀과 겹치지 않습니다.
- 신호가 분비된 항-c-myc 항체에 특이적인지 확인하기 위해, 항체가 존재하거나 존재하지 않는 세포 배양 배지를 항체와 함께 도입하되, 용액 내 c-myc 펩타이드의 포화 농도의 존재에 의해 결합 부위가 차단된 세포 배양 배지를 도입합니다.
- 각 실행이 끝날 때 anti-c-myc 항체의 포화 용액(250nM)으로 센서를 보정합니다. 이는 센서의 반응을 정규화하고 각 실행의 생체 기능화 프로파일을 기반으로 부분 점유를 결정하는 데 도움이 됩니다.
- 이미지 정렬 소프트웨어를 사용하여 X 및 Y 방향의 드리프트를 수정합니다.
