이미지 기반 미세중화 분석을 사용한 바이러스 간의 항원 관계 분석

Abstract

출처: Lin, Y., et al. 정량적 마이크로 중화 분석의 최적화. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 인플루엔자 A와 B 바이러스 간의 항원 관계를 분석하기 위한 이미징 기반 미세 중화 분석을 보여줍니다. 바이러스 감염 예방에 대한 항체 또는 기타 치료법의 효과를 평가할 수 있는 정량적이고 시각적인 방법을 제공합니다.

Protocol

1. 바이러스 적정

참고: 바이러스의 수와 중복의 수에 따라 웰 플레이트를 다음과 같은 유연성으로 설정할 수 있습니다: (1) 바이러스 희석은 행 또는 열을 따라 배열될 수 있습니다(그림 1). 각 바이러스는 별도의 행/열을 차지해야 합니다. (2) 바이러스 희석 증가는 유연하지만 왼쪽 상단 모서리에서 가장 높은 바이러스 농도부터 시작해야 합니다. (3) 중복 횟수에는 제한이 없습니다.

1. 충분한 MDCK 세포 또는 MDCK-SIAT cells8을 96웰 플레이트(200μl/well)에 분취합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂로 세포를 2 일 또는 3 일 동안 배양하여 합류점에 도달합니다. 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS)과 항생제(100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신)가 보충된 DMEM에서 세포를 증식시킵니다. 37 ° C에서 5 % CO₂ 및 1 mg / ml G418 sulfate로 SIAT 세포를 배양합니다 .
   메모: 희석 계수는 경험과 사용된 세포주에 따라 달라집니다. 세포 단층은 바이러스 접종 시 융합(즉, MDCK 세포의 경우 세포벽이나 눈에 띄는 윤곽이 없어야 하며 MDCK-SIAT1 세포의 경우 빽빽하게 채워진 레이아웃)이어야 합니다. MDCK 또는 MDCK-SIAT1 세포의 융합 플라스크의 subculture에 기초한 희석액의 예가 표 1에 나와 있습니다.
2. 웰당 200μl의 바이러스 성장 배지(VGM)로 세포를 3회 세척합니다. 다중벽 플레이트 세척기를 70% EtOH로 30분 동안 멸균한 다음 세척 전에 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 VGM으로 헹굽니다.
3. VGM을 흡입하고 즉시 각 웰에 50μl의 VGM을 추가합니다.
4. 6개의 멸균 튜브 각각에 900μl의 VGM을 추가합니다(또는 테스트 바이러스 및 중복 수에 따라 더 적음). 첫 번째 튜브에 바이러스 100μl를 피펫으로 넣고 잘 섞은 후 연속으로 희석하여 각 희석 사이의 팁을 변경합니다. 적정할 각 바이러스에 대해 반복합니다.
   메모: 이렇게 하면 바이러스가 ^{10-1에서 10-6}으로 희석됩니다.
5. 가장 높은 희석액(그림 1의 1 x 10-5)에서 시작하여 각 바이러스 희석 50μl를 96웰 플레이트의 중복된 웰(그림 1의 9열 및 10열)에 추가합니다.
6. 바이러스가 세포를 감염시킬 수 있도록 플레이트를 37°C에서 2-3시간 동안 놓습니다.
   메모: 접종물 내 바이러스가 단층에 도달할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 하기 위해 2-3시간의 배양이 필요합니다.
7. 오버레이 준비 (10ml / 플레이트)
   메모: 오버레이는 5ml의 2x DMEM, 트립신(2μg/ml 최종 농도), 20μl의 1mg/ml 스톡, 5ml의 셀룰로오스 면 린터로 구성됩니다(재료 목록 참조).
8. 접종물을 제거하십시오.
9. 오버레이를 추가합니다(각 웰에 200μl). 37 ° C에서 밤새 방해받지 않고 배양하십시오 .
   메모: 바이러스는 약 4시간 후에 발아하므로 이 시간이 지나면 플레이트가 방해받지 않는 것이 중요합니다.
10. 우물에서 오버레이를 흡입합니다.
11. PBS A(200μl/well)에 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드를 추가합니다. 4°C에서 30분 동안 또는 실온에서 20분 동안 두십시오.
    참고: PBS A는 NaCl 10g, KCl 0.25g, Na₂HPO₄ 1.437g, KH_2PO4 0.25g 및 증류수 1L가 포함된 천연 pH 인산염 완충 식염수입니다(재료 목록 참조).
    알림: 파라포름알데히드는 흡입 시 유해하며 삼키면 화상을 입을 수 있습니다. 또한 발암 효과에 대한 증거는 제한적이며 피부 접촉 후 감작을 유발할 수 있습니다.
12. 파라포름알데히드를 흡입하고 PBS A(200μl/well)로 플레이트를 두 번 세척합니다.
13. 나중에 사용할 수 있도록 4°C의 PBS A에 플레이트를 보관하거나 다음 단계를 수행하십시오.
14. 투과화 완충액(100μl/well)을 추가합니다. 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.
15. PBS A(200μl/well)로 플레이트를 두 번 세척합니다.
16. 웰당 인플루엔자 A형에 대한 첫 번째 항체인 마우스 MAb 50μl(ELISA Buffer에서 1:1,000)를 추가합니다. 실온에서 1시간(또는 4°C) 동안 흔들어 배양합니다.
17. 웰당 100μl의 세척 버퍼(0.05% Tween 80 in PBS A, v/v)로 3회 세척합니다. 세탁 사이에 5분 동안 실온에서 배양하십시오. 또는 웰당 300μl를 사용하여 배양 없이 3회 세척합니다.
18. 웰당 두 번째 항체인 염소 항-마우스 IgG(H+L) HRP 접합체(ELISA Buffer에서 1:1,000)의 50μl를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 흔들면서 배양합니다.
19. 3단계에서 설명한 대로 1.17회 세탁합니다.
20. 기판(50μl/well)을 추가합니다. 실온에서 30분 동안 또는 파란색이 명확하게 보일 때까지 배양합니다.
21. 반응을 중지하려면 웰 당 200 μl의 증류수로 플레이트를 두 번 세척하고 세척 사이에 2-3 분 동안 실온에서 배양합니다.
22. 접시를 자연 건조하고 어두운 곳에 보관하십시오(예: 알루미늄 호일로 싸십시오).

2. 바이러스 무력화

참고: 중화 분석에 필요한 플레이트의 수를 계산합니다. 각 플레이트는 하나의 바이러스와 여러 개의 안티세라를 수용할 수 있습니다.

참고: 항혈청의 수와 중복의 수에 따라 웰 플레이트는 다음과 같은 유연성으로 설정할 수 있습니다: (1) 혈청 희석은 행 또는 열을 따라 배열될 수 있습니다(그림 2). 각 세럼은 별도의 행 또는 열을 차지해야 합니다. (2) 혈청 희석의 증가는 유연하지만, 플레이트의 왼쪽 상단 모서리에서 가장 높은 혈청 농도부터 시작해야 합니다. (3) 중복의 수는 antisera의 수와 균형을 이룹니다. 중복이 많을수록 실험 변형을 매끄럽게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. (4) VC의 수와 셀 제어(CC) 중복의 수는 유동적이지만 별도의 행이나 열에 있어야 합니다. VC 중복의 수는 antisera의 수보다 훨씬 많을 것으로 예상됩니다.

1. 1.1-1.3단계, 2일 또는 3일 전과 같이 세포 단층을 준비합니다.
2. 플레이트의 각 웰에 VGM 50μl를 추가합니다.
3. VC 및 CC에 대해 각각 열 11 및 12를 사용합니다. 1:20 수용체 파괴 효소(RDE) 처리 혈청 50μl를 1-10.
   열의 첫 번째 줄(A)에 추가합니다. 메모: 각 바이러스 및 혈청 조합에 대해 분석이 중복으로 수행되므로 예를 들어 하나의 플레이트에 5개의 항혈청에 대해 테스트된 하나의 바이러스가 포함될 수 있습니다.
4. A행에서 H행(그림 2의 1-10열)으로 50μl를 옮기고 H행에서 50μl를 버리는 방법으로 2배 연속 희석을 수행합니다.
5. CC 컬럼의 각 웰(그림 2의 컬럼 12)의 각 웰에 50μl의 희석액을 추가합니다.
6. CC 컬럼(그림 2의 1-11열, AH 행)을 제외한 플레이트의 각 웰에 바이러스 50μl를 추가합니다.
7. 37 ° C에서 2-3 시간 동안 배양하십시오. 접종물을 제거하십시오. 각 웰에 오버레이(200μl)를 추가합니다. 37 ° C에서 밤새 방해받지 않고 부화하십시오. 바이러스 적정에 따라 플레이트를 고정하고 염색합니다(단계 1.11-1.22).

3. 중화 정량화

1. 그림 2a와 같이 평판 스캐너의 스캐닝 영역에 웰 플레이트를 놓습니다. 최적의 반복 가능한 이미징 위치를 보장하기 위해 L자형 위치 한계를 사용하십시오.
   메모: 한 번의 스캔으로 두 개의 웰 플레이트를 이미지화할 수 있습니다.
2. 플레이트를 스캔합니다.
3. "Wellplate Reader" 소프트웨어를 실행하여 필요한 바이러스 역가를 계산합니다(그림 3).
   1. "이미지 로드" 버튼을 클릭하여 이미지를 로드합니다. "Global Threshold"에서 빨간색 막대를 밀어 샘플링 임계값을 조정합니다. "업데이트" 버튼을 클릭하여 효과를 검토하십시오.
   2. "Calculate Neutralization/Titration(중화/적정 계산)" 상자를 선택합니다. "샘플링" 버튼을 클릭하여 ICP를 정량화합니다. "저장" 버튼을 클릭하여 s를 저장합니다.amp메시지가 표시되면 결과를 저장합니다.
      메모: 샘플링 공정 후, "Calculate Neutralization/Titration" 상자를 선택하면 "Neutralization & Titration Calculation"이라는 새로운 창이 자동으로 나타납니다.
   3. 웰 플레이트 맵을 로드하거나 입력합니다. "Neutralization: Infection Deduction (%)"에 임계값(예: 50%)을 표시합니다.
   4. "Neutralization Process"를 선택하여 역가를 계산합니다. 역가를 확인하고 "Save & Close" 버튼을 클릭하여 중화 결과를 저장합니다.
      메모: 중화는 VC(그림 4의 열 11의 평균)에 대해 사전 정의된 ICP 감소(예: 50% 또는 80%)로 혈청의 가장 높은 희석의 역수로 보고됩니다. 대표 결과에는 50% ICP 감소가 사용되었습니다.

Results

그림 1 : 바이러스 적정 실험에서 웰 플레이트 설정의 예. 테스트 바이러스는 별도의 행(A에서 H)에 할당됩니다. 컬럼은 다양한 바이러스 희석(1 - 12)을 위해 설계되었습니다. 두 개의 컬럼이 각 바이러스 희석에 대한 중복으로 사용되었습니다. 스케일 바 = 10mm.

그림 2: 샘플 스캐닝 시스템의 개략도. (a) 평판 스캐너의 이미징 위치에 있는 96웰 플레이트와 (b

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
재질 보기	시그마	D6429, P0781	500 ml DMEM + 5 ml 펜/스트렙
PBS 에이			자연 pH 인산염 완충 식염수: NaCl 10g, KCl 0.25g, Na2HPO4 1.437g, KH2PO4 0.25g 및 Dist. 물 1L
아비셀	FMC (에프엠피	RC-581F	100ml 증류수에 2.4g을 자석 교반기에서 교반하여 1시간 동안 용해시킵니다. 오토클레이빙으로 살균
DMEM 2개	지브코	21935-028
트립신	시그마	T1426
오버레이 (10ml / 플레이트) :			5 ml 2x DMEM, 트립신 2 μg/ml 최종 농도, Avicell 5 ml
트리톤 X- 100 e	시그마	T8787	투과 버퍼: PBS A에서 0.2%(v/v)
트윈 80	시그마	P5188	세척 버퍼: 0.05% 트윈 80 in PBS A (v/v)
호스 세럼	PAA 연구소 주식회사	나15-021	ELISA 버퍼: PBS A에서 10%(v/v) + 0.1% 트윈 80
인플루엔자 A형에 대한 마우스 MAb	비오라드	MCA 400	1st 항체: 1:1,000 in ELISA Buffer
염소 안티 마우스 IgG (H + L) HRP 접합체	비오라드	제172-1011	2차 항체: 1:1,000 in ELISA Buffer
트루 블루 퍼옥시다제 기질	KPL	50-78-02	기판 : 트루 블루 + 0.03 % H2O2 g (1 : 1,000 / 30 % 용액)
96웰 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트	코스타	3596
8채널 멀티월 플레이트 세척기 및 매니폴드	시그마	M2656
퍼펙션 플레이트 스캐너	엡손	V750 프로	이미징 소프트웨어는 http://www.epson.com/cgi-bin/ Store/support/supDetail.jsp? oid=66134&infoType=Downloads에서 자유롭게 다운로드할 수 있습니다.
소프트웨어 운영 환경: LabVIEW	내쇼날인스트루먼트 코퍼레이션	NI Vision 빌더로 기반 윈도우	버전: LabVIEW2012 이상