방법 논문

포유류 세포에서 벌크 자가포식 격리 활성(Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells) 정량화

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Luhr, M. et al., The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells(젖산 탈수소효소 격리 분석 - 포유류 세포에서 대량 자가포식 격리 활성을 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법). J. Vis. 특급. (2018년)

이 비디오는 포유류 세포에서 벌크 자가포식 격리 활성을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 전기천공법을 활용하여 젖산 탈수소효소(LDH)를 포함한 세포질 단백질을 방출합니다. 격리된 LDH 및 총 세포 LDH 분획은 LDH 격리를 평가하기 위해 결정되어 전체 벌크 격리 활성에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 파종 및 치료

  1. 해당 세포 유형에 대해 선호되는 배양 배지를 사용하여 37°C에서 5%CO2를 함유한 가습된 인큐베이터에서75cm2 조직 배양 플라스크에서 부착 세포를 배양합니다. 세포가 거의 합류하는 세포층에 도달할 때까지 성장하도록 합니다.
    메모: LNCaP, HEK293, 마우스 배아 섬유아세포(MEF), BJ, MCF-7 및 RPE-1 세포에 대해 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지를 사용합니다.
    1. 3mL 37°C 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4로 세포를 세척합니다. PBS를 3mL 0.25%(w/v) 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 교체하고 세포가 분리될 때까지(2-5분) 37°C에서 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 플라스크를 배양합니다.
    2. 10% FBS를 함유한 7mL 배양 배지로 분리된 세포를 재현탁합니다. 0.5–20 μL 피펫 팁을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 10 μL 세포 현탁액 분취액과 10 μL 0.4% Trypan Blue를 혼합합니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 계수 챔버 슬라이드를 즉시 채우고 자동화된 세포 카운터에서 세포를 계수합니다.
  2. 10% FBS를 함유하는 배양 배지를 사용하여 1.1.2단계에서 세포 현탁액의 적절한 희석액(아래 참고 참조)을 준비하고, 무균 기술을 사용하여 12웰 조직 배양 플레이트(표면적 ~3.8cm2)의 각 웰에 희석된 세포 현탁액 1mL를 시딩합니다. 원하는 세포 밀도(예: 수확 시 60–90% 합류)에 도달할 때까지 37°C에서 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 성장을 허용합니다.
    메모: 수확 시 원하는 세포 포화도를 제공하는 세포 현탁액의 적절한 희석은 세포 유형마다 다를 뿐만 아니라 실험적 처리의 기간과 유형에 따라 다릅니다. 따라서 이는 각 사례에서 경험적으로 평가되어야 합니다.
    1. 파종 2일 후 처리 및 수확해야 하는 실험의 경우, 12웰 플레이트의 각 웰에 2.5 x 105 LNCaP, HEK293 또는 MCF-7 세포, 5 x 104 MEF, 4 x 105 BJ 또는 1.5 x 105 RPE-1 세포를 파종합니다.
    2. 느슨하게 부착되는 세포의 경우 해당 세포 유형에 권장되는 코팅 유형으로 플레이트를 코팅하십시오. LNCaP(및 HEK293) 셀의 경우 폴리-D-라이신(PDL)으로 코팅된 플레이트를 사용합니다.
    3. 이를 위해 멸균 H2O에 2.5μg/mL의 500μL PDL을 각 웰에 첨가하고 실온(20–25°C)에서 30분 동안 멸균 환경에서 플레이트를 배양합니다. 흡입으로 PDL을 제거하고 1mL 멸균 H2O.
      로 각 웰을 짧게 세척합니다. 메모: 일반적으로 1.2.1단계는 실험적 처리 없이 수행됩니다. 그러나, RNAi를 수행하는 경우, 시딩과 함께 역 형질주입을 시작하는 것이 편리할 수 있다.
  3. 조건별 중복 또는 삼중 웰에서 실험적 처리를 수행합니다.
    1. 예를 들어, 일반적으로 자가포식 격리의 효율적인 유도제인 mTOR-억제제 Torin1 50nM로 세포를 처리하거나, 1mL의 아미노산이 없는 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS) 배지로 세포를 세척하여 세포를 급성 혈청 및 아미노산 결핍에 노출시킨 후, 37°C에서 5% 이산화탄소(CO2)가 함유된 가습 인큐베이터에서 1mL의 EBSS로 세포를 배양합니다.
    2. 침전 가능한 젖산 탈수소효소(LDH)의 배경 수준을 정의하기 위해 한 세트의 우물을 처리하지 않은 상태로 둡니다.
    3. 세포 수확 3-4시간 전에 실험적 처리의 부재 또는 존재 시 격리 후 억제제 bafilomycin A1(Baf)의 포화량을 추가합니다. 37°C에서 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
      1. LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 및 RPE-1 셀에는 100nM Baf를 사용하고 MEF에는 10nM Baf를 사용합니다.
      2. 지속 시간이 3-4시간에 불과한 실험적 처리의 경우(예: 1.3.1단계에서 예시된 것과 같이 일반적으로 있음) 처리와 동시에 Baf를 추가합니다. 더 긴 실험적 처리를 위해 수확 3-4시간 전까지 기다렸다가 500배 농축된 Baf 스톡 2μL를 배지에 직접 첨가하십시오.
      3. Baf를 첨가한 직후 플레이트를 교반하여 혼합합니다. 이 시점에서는 거대자가포식(macroautophagic sequestration) 억제제를 대조군으로 추가하는 것도 권장됩니다(예: 10mM의 pan-phosphoinositide 3-kinase(PI3K) 억제제 3-methyl adenine(3MA) 또는 10μM의 선택적 PI3K class III 억제제 SAR-405.

2. 세포 수확 및 전기 파괴 준비

  1. 처리 기간이 끝나면 흡입으로 배지를 흡인하고 각 웰에 200μL 세포 박리 용액(37°C로 예열)을 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 배양합니다(일반적으로 약 5분).
    메모: 세포 분리 용액 대신 0.25%(w/v) Trypsin-EDTA를 사용할 수 있는 반면, 후자는 분리된 세포의 점도를 낮추는 데 도움이 되는 DNase를 함유하고 있습니다. 배지가 완전히 흡인되는 한, 트립신-EDTA 또는 세포 분리 용액을 첨가하기 전에 세포를 세척할 필요가 없습니다.
  2. 각 웰에 2%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 500μL의 실온(20-25°C) PBS, pH 7.4를 추가하고 세포 덩어리가 보이지 않을 때까지 피펫으로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 얼음 위의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 즉시 옮깁니다.
    메모: 달리 명시되지 않는 한 얼음 위에서 이후의 모든 단계를 수행하십시오.
  3. 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전합니다.
  4. 상층액을 완전히 흡인하여(흡입 포함) 세포 펠릿을 가능한 한 건조하게 유지합니다.
  5. 각 튜브에 400 μL 10%(w/v) 자당(초순수 H2O)을 추가합니다.

3. 원형질막(plasma membrane) 전기파괴 및 침전성 및 전체 세포 분획의 분리

  1. 세포 펠릿을 피펫으로 재현탁하여 거의 단일 세포 현탁액을 얻고 4mm 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다.
    메모: 일반적으로 100–1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 ~10-15회 위아래로 피펫팅하는 것으로 충분합니다.
  2. 큐벳을 지수 감쇠파 electroporator에 놓고 800V, 25μF 및 400 Ω에서 단일 전기 펄스를 방전합니다. 이러한 설정은 ~8ms 지속 시간의 펄스를 생성합니다.
  3. 새 피펫 팁을 사용하여 세포 파괴물을 400μL 얼음처럼 차가운 인산염 완충 자당 용액(100mM 일인산나트륨, 2mM 디티오트레이톨(DTT), 2mM EDTA 및 1.75% 자당, pH 7.5)이 포함된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 피펫팅으로 간단히 혼합합니다.
    1. 선택 사항: 효율적인 원형질막 전기 파괴를 확인하기 위해 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에서 3.3단계에서 희석된 세포 파괴 물질 10μL를 10μL 0.4% 트리판 블루와 혼합합니다. 계수 챔버로 옮겨 Trypan Blue 양성 세포의 비율이 >99%인지 확인합니다.
      1. 샘플을 실온(20–25°C)에서 30분 동안 계수 챔버에 그대로 두고 Trypan Blue 양성 세포의 비율이 >99%로 유지되었는지 확인합니다.
    2. 선택 사항: 전기 파괴가 너무 가혹하지 않은지, 즉 세포 내 소기관을 파괴하지 않았는지 확인하려면 위에서 설명한 대로 1.1–3.3단계를 수행하되 더 큰 출발 물질(~80% 융합 세포층이 있는 6웰 플레이트의 웰)을 사용하고 2.5단계에서 150μL 10% 슈크로스를 사용하고 3.3단계에서 DTT가 없는 150μL 인산염 완충 슈크로스 용액을 사용합니다.
      1. 피펫을 사용하여 2mL 원심분리 튜브에서 인산염 완충 8%(w/v) 밀도 구배 배지(예: 8% Nycodenz, 50mM sodium phosphate, 2.2% sucrose, 1mM EDTA)의 1.2mL 밀도 쿠션 위에 희석된 세포 파괴 용액 200μL를 조심스럽게 층을 이룹니다. 소프트 모드 기능(완만한 가속 및 감속용)이 있는 마이크로 원심분리기에서 20,000 x g에서 45분 동안 4분 동안 원심분리기를 가열하고 튜브를 얼음 위에 조심스럽게 놓습니다.
      2. ~200 μL 상단 분획 중 60 μL를 조심스럽게 제거하고, 밀도 구배 매체 용액을 선택하지 않도록 한 다음 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
        메모: 여기에는 "세포 수액(cell sap)"이라고 하는 탁월한 순도의 세포질이 포함되어야 합니다.
      3. 표준 기술과 4–20% 구배 겔을 사용하여 소기관 함유 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 위 단계에서 얻은 분획의 순도를 테스트합니다.
      4. 예를 들어 cathepsin B, cytochrome c 및 protein disulfide isomerase에 대한 면역 블로팅을 수행하여 3.2단계의 전기 충격이 각각 리소좀, 미토콘드리아 또는 소포체를 파괴하지 않았는지 확인하고 LDH에 대한 면역 블롯을 수행하여 세포 수액에 세포질 단백질의 존재를 확인합니다.
      5. 이와 동시에 total cell disruptate 용액에서 만든 단백질 추출물에 대해 면역 블로팅을 수행하여 사용된 항체가 평가 중인 소기관 함유 단백질을 검출할 수 있는지 확인합니다.
  4. 각 샘플에 대해 3.1–3.3단계를 반복합니다.
  5. 0.5% BSA 및 0.01% Tween-20이 보충된 900μL 빙냉 재현탁액(50mM 일인산나트륨, 1mM DTT, 1mM EDTA 및 5.9% 슈크로스, pH 7.5)이 포함된 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 희석된 각 세포 파괴 용액(3.3단계에서 획득)에서 550μL를 제거하고 피펫팅으로 간단히 혼합합니다.
  6. 18,000 x g에서 45 °C에서 45분 동안 원심분리기를 사용하여 "침전된 LDH"를 함유한 펠릿을 생성합니다. 펠릿을 가능한 한 건조하게 유지하기 위해 상등액(흡입 포함)을 철저히 흡인합니다. 샘플을 -80°C 냉동고에 넣습니다.
  7. 희석된 각 세포 파괴 용액(단계 3.3에서 얻음)에서 150μL를 새 튜브로 옮기고 샘플을 -80°C 냉동고에 넣습니다. 이 샘플을 사용하여 세포의 "총 LDH" 수치를 확인합니다.
    메모: 이 시점에서 원하는 만큼 실험을 일시 중지할 수 있습니다.

4. LDH 추출 및 LDH 효소 활성 측정

  1. "침전된 LDH"(3.6단계) 및 "총 LDH" 샘플(3.7단계)을 얼음 위에서 해동합니다.
  2. 1.5% Triton X-405를 함유한 300μL의 얼음처럼 차가운 재현탁액을 "총 LDH" 샘플에 추가합니다(최종 Triton X-405 농도 1% 생성). 샘플의 샘플을 차가운 방(4–8 °C)의 롤러에서 30분 동안 회전시킵니다.
  3. "침전된 LDH" 샘플에 1% Triton X-405가 함유된 750μL의 얼음처럼 차가운 재현탁액을 추가하고 균일한 용액에 도달할 때까지 펠릿을 피펫으로 재현탁합니다.
  4. 18,000 x g에서 4.2 및 4.3 단계의 샘플을 4 °C에서 5분 동안 원심분리하여 용해되지 않은 세포 파편을 침전합니다.
  5. 차가운 65mM 이미다졸(pH 7.5)/0.75mM 피루브산염 4부와 차가운 65mM 이미다졸(pH 7.5)/1.8mM NADH 1부를 혼합하여 4°C에서 최소 3주 동안 안정적인 작업 용액을 얻습니다.
  6. 4.4단계의 상등액 3–30μL를 4.5단계 작업 용액의 200μL와 혼합합니다.
  7. LDH 농도가 알려진 표준과 비교하여 37°C에서 340nm에서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(환원형)(NADH) 흡광도의 감소로 LDH 효소 활성을 측정하여 LDH의 양을 측정합니다. 반응이 완료될 때까지, 즉 340 nm에서의 흡광도가 더 이상 시간에 따라 변하지 않을 때까지 흡광도 측정을 수행합니다.
    메모: 이것은 LDH 활성을 측정하는 고전적인 생화학적 방법입니다. 현재 프로토콜은 37°C에서 반응을 수행하지만 실온(20–25°C)에서도 수행할 수 있으므로 수동 분광 광도계를 수행하는 경우 권장됩니다. 현재 프로토콜은 자동화된 방식으로 96웰 플레이트에서 시료와 작업 용액을 혼합하고 3분 동안 20초마다 37°C에서 340nm의 흡광도를 측정하는 로봇 다중 분석기 기기를 사용합니다. 그 후, 기기 소프트웨어는 알려진 LDH 농도 표준으로 보정을 통해 얻은 표준 곡선과 비교하여 시간 경과에 따른 흡광도 측정의 기울기를 비교하여 단위(U)/L로 표시되는 LDH 농도를 계산합니다. 이 접근 방식에 의한 검출의 선형 범위는 30–1,500U/L입니다. 대안으로, LDH를 측정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 다양한 키트가 존재합니다. 그들 중 일부는 효소 반응을 비색 또는 형광 제품의 생성에 결합하는 것을 기반으로 하여 UV 분광 광도법 이외의 다른 수단 및 다른 선형 감지 범위와 함께 검출할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 ml 및 2 ml 마이크로 원심분리기 튜브 에펜도르프211-2130 및 211-2120
12웰 플레이트 송골매353043
Accumax 세포 분리 솔루션혁신적인 셀 기술A7089부분 표본은 -20 °C에서 몇 년 동안 보관하고 냉장고에 몇 달 동안 보관하십시오
바필로마이신 A1엔조BML-CM110-0100DMSO에 디졸브
BJ 세포증권 시세CRL-2522통로 <30에서 사용
소 혈청 알부민(BSA)폭스바겐422361볼트
버커 계수 챔버피셔 사이언티픽139-658585
Countess Cell Counting Chamber 슬라이드써모피셔 사이언트픽C10228
Countess II 자동 세포 계수기써모피셔 사이언트픽AMQAX1000
Burker 계수실용 커버 유리피셔 사이언티픽전화: 139-658586
Criterion Tris-HCl 겔, 4–20%, 26-웰, 15μl, 13.3 x 8.7cm(W x L) 바이오 라드3450034
디티(DTT)시그마-알드리치D0632
얼의 균형 잡힌 소금 용액(EBSS)지브코24010-043코나테인 0.1% 포도당
에디타시그마-알드리치E7889
전기천공법 큐벳(4mm)바이오 라드1652088
지수 감쇠파 electroporatorBTX 하버드 장치 엠씨 630
소 태아 혈청(FBS)시그마F7524RPMI 1640 배지의 최종 농도 10%
HEK293 셀증권 시세CRL-1573
이미다졸시그마-알드리치5675065mM 용액을 오토클레이브하고 몇 달 동안 냉장고에 보관하십시오
부 화기; Autoflow IR 직접 가열식 CO2 인큐베이터누아이레NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX 트랜스펙션 시약써모피셔13778150
LNCaP 셀증권 시세CRL-1740통로 <30에서 사용
3-메틸 아데닌(3MA)시그마-알드리치M9281-20°C에서 RPMI로 100mM를 비축하고 스톡을 65°C로 10분 동안 가열하고 10mM 최종 농도에서 사용합니다
냉장 마이크로 원심분리기벡크만쿨터 생명과학368831
소프트 모드 기능이 있는 냉장형 마이크로 원심분리기에펜도르프 에펜도르프 5417R
염(ULKi)시그마-알드리치SML0702ULK 키나아제 활성을 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.
MaxMat 다중 분석기 기기Erba 진단PL-II
MCF7 세포증권 시세HTB-22
나드머크-밀리포어1.24644.001
니코덴츠축 방패1002424
Opti-MEM 리듀스 세럼 미디엄써모피셔31985062
인산염 완충 식염수(PBS)지브코20012-019
피펫 팁 3 (0.5-20 μl)폭스바겐732-2223Thermo Fischer ART 배리어 팁
피펫 팁(1-200 μl)폭스바겐Tel.: 732-2207 Thermo Fischer ART 배리어 팁
피펫 팁(100-1000μl)폭스바겐Tel.: 732-2355 Thermo Fischer ART 배리어 팁
피 펫써모피셔4701070Finnpipette F2 GLP 키트
폴리-D-라이신시그마-알드리치P6407-10X5MG멸균 H2O에 1mg/ml 원액을 만듭니다. 이 용액은 -20°C에서 최소 1년 동안 안정적입니다.
피루브산머크-밀리포어1066190050
RPE-1 세포(hTERT RPE-1)증권 시세CRL-4000 (영문
RPMI 1640지브코21875-037
증권 시세 표시기 SAR-405에이펙스바이오 A8883포스포이노시티드 3-키나아제 클래스 III(PIK3C3)을 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.
소음기 네거티브 컨트롤 #1 선택 (siCtrl)써모피셔/앰비온4390843
소음기 Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)써모피셔/앰비온S35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)써모피셔/앰비온s18995
소음기: ULK1 표적 siRNA(siULK1) 선택써모피셔/앰비온에스15964
소음기: ULK2 표적 siRNA(siULK2) 선택써모피셔/앰비온s18705
소음기 GABARAP 표적 siRNA (siGABARAP) 선택써모피셔/앰비온에스22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)써모피셔/앰비온s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)써모피셔/앰비온에스22387
인산나트륨 일염기성 이수화물(NaH2PO4 • 2H2O) 머크-밀리포어1.06580.1000
인산나트륨 이염기성 이수화물(Na2HPO4 • 2H2O) 프롤라보제28014.291
자당폭스바겐443816티물에 있는 10% 마지막 농도; 0.45 μm 여과기를 통해서 걸러지고 수개월 동안 냉장고에서 두십시오
타프시가르긴시그마-알드리치T9033SERCA ER Ca2+ 펌프를 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.
트리톤 X-405 시그마-알드리치X405결승 1%
트리판 블루 스테인 0.4%분자 프로브T10282
트립신-EDTA (0.25% w/v 트립신)지브코제25200-056
트윈-20시그마-알드리치P22870.01% 최종
. 표시기 (영문) 년 표시기 년 . 표시기 (영문) . MRT67307염산 표시기 년 년 표시기 ) 년 호 호 (영문)

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

LDHTriton X 405LDH

관련 논문