Mycobacterium tuberculosis 감염 모델에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 분석

초록

출처: Schaaf, K., et al. 대식세포 패시지 마이코박테리움 결핵에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 고처리량 호환 분석법. J. Vis. 특급. (2017년)

이 동영상은 결핵균(Mtb) 감염에 대한 약물의 효능을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 생체 내 감염을 모방하는 Mtb/대식세포 응집체를 포함하는 체외 감염 모델이 생성됩니다. 적절한 항생제를 도입하면 약물 농도가 증가하는 박테리아의 생존을 모니터링하기 위해 레수자린 분석을 통해 그 효능을 테스트합니다.

프로토콜

1. M. tuberculosis mc²6206 (Mtb-GFP)을 발현하는 녹색 형광 단백질의 배양 조건

참고: 플라스미드 pMN437을 발현하는 gfp(녹색 형광 단백질)로 형질전환된 M. tuberculosis H37Rv 유래 auxotroph 균주 mc²6206 (ΔpanCD, ΔleuCD)이 이 프로토콜 전반에 걸쳐 사용됩니다. Mtb-GFP 균주를 야생형 균주를 발현하는 non-gfp로 대체하여 연구자가 균주에 더 쉽게 접근할 수 있도록 할 수 있습니다. 그러나 gfp 발현은 phagocytosis의 시각적 확인 및 Mtb/대식세포 응집체의 형성을 가능하게 하는 것이 바람직합니다. 장기 보관을 위해 Mtb-GFP는 20% 글리세롤이 보충된 완전한 7H9 배지(단계 1.1에 설명됨)에서 -80°C에서 동결되었습니다.

1. 7H9 배지에 10% Middlebrook OADC(올레산 알부민 덱스트로스 카탈라아제), 0.02% 틸록사폴, 24μg/mL D-판토텐산, 50μg/mL L-류신 및 50μg/mL 하이그로마이신 B를 보충하여 완전한 Mtb-GFP 배지(7H9-C)를 준비합니다.
2. Mtb-GFP 바이알 1개를 해동하고 30mL 정사각형 바닥 PETG 플라스크에 7H9-C 10mL를 추가합니다.
3. 37 °C에서 로터리 쉐이커(50 rpm)로 배양합니다. OD₆₀₀이 1.0(약_5-8일)에 도달할 때까지 며칠에 한 번씩 광학 밀도 측정(OD 8)을 수행합니다.
4. 0.2-1.0 사이의 OD₆₀₀을 유지하기 위해 필요에 따라 희석 및 계대 배양.
5. 감염의 경우, 로그 성장 단계(OD₆₀₀ of 0.6-1) 내에 확립된 Mtb-GFP 배양액을 사용하십시오. 덩어리진 배양을 피하려면 일주일에 한 번 또는 두 번 수조(130W, 3 x 5s 펄스)에서 Mtb 배양 플라스크를 초음파 처리합니다.

2. THP-1 세포의 배양 조건

1. RPMI 1640 배지에 10% 열 비활성화 소 태아 혈청, 2mM L-글루타민 및 10mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)을 보충하여 완전한 THP-1 세포 배지(RPMI-C)를 준비합니다.
2. 5%_CO2의 가습 분위기에서 37°C의 T-75 플라스크에서 세포를 배양합니다.
3. 격일로 혈구분석기 또는 유세포분석을 사용하여 세포 수를 계산하고 THP-1 세포를 mL당 0.1 - 0.6백만 사이의 밀도로 유지합니다.

3. mtb/대식세포 응집체 구조를 생성하기 위한 감염 프로토콜

1. THP-1 세포 준비(96웰 플레이트당)
   1. 원심분리기 7 x 10⁶ THP-1 세포를 250 x g에서 5분 동안 7mL RPMI-C에 재현탁합니다.
2. Mtb-GFP 제제
   1. OD₆₀₀ 1.0 = 3 x 10⁸ bacteria/mL의 변환을 사용하여 스윙 버킷 원심분리기에서 5분 동안 3,200 x g에서 2.8 x 10⁸ Mtb-GFP 원심분리기.
   2. 3.2.1단계와 같이 RPMI-C와 원심분리기로 한 번 세척합니다.
   3. 7mL RPMI-C에 재현탁하고 10초 동안 와류에 현
   탁합니다.
3. 감염
   참고: 템플릿에 대해서는 그림 1을 참조하십시오.
   1. 배양 배지의 증발을 방지하기 위해 A와 H열, 1열과 12열에 200μL의 멸균수를 추가하여 96웰 플레이트를 준비합니다.
   2. 백그라운드 제어(블랭크)를 위해 200μL RPMI-C를 열 2(B2 - G2)에 추가합니다.
   3. 감염시키려면 THP-1 세포 현탁액(3.1단계)에 Mtb-GFP 현탁액(3.2단계)을 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 최종 THP-1 세포 밀도는 5 x 10^{mL당 5}이며 해당 감염 다중도는 40입니다.
   4. THP-1/Mtb-GFP 현탁액을 25mL 용기에 붓습니다.
   5. 멀티 채널 피펫을 사용하여 나머지 96웰(B3 - G11)에 200μL의 THP-1/Mtb-GFP 현탁액을 추가합니다.
      메모: 여러 개의 96웰 플레이트로 작업하는 경우 저장소에 남아 있는 THP-1/Mtb 현탁액을 정기적으로 현탁하여 각 웰에 균일한 혼합물이 추가되도록 합니다.
   6. 37 ° C에서 5 % CO₂로 7-10 일 동안 배양합니다.
   7. 각 웰 상단에서 100μL의 사용 배지를 천천히 제거하고 다중 채널 피펫을 사용하여 100μL 예열된 RPMI-C를 부드럽게 첨가하여 2일마다 배지를 교체합니다. 우물을 다시 부유시키고 우물 바닥의 Mtb/대식세포 응집체를 방해하지 마십시오.
   8. 매일 형광 현미경(4-10X 대물렌즈)으로 웰을 육안으로 검사하고 Mtb/대식세포 응집체의 크기를 기록하십시오. 7-10일째까지 Mtb/대식세포 응집체는 약물 효능 검사를 진행할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다(참고로 그림 2 참조).
   9. 원하는 경우 명시야 및 GFP 필터 세트가 장착된 자동 세포 이미징 시스템을 사용하여 96웰의 이미지를 캡처하여 Mtb/대식세포 응집체 형성을 문서화할 수 있습니다.
      메모: 사용자가 자동 이미징 시스템에 액세스할 수 없는 경우 GFP 및 명시야 기능이 있는 적절한 현미경을 사용하여 대표 웰의 이미지를 촬영할 수 있습니다.

4. mtb/대식세포 응집체에서 유래한 mtb에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 성장 억제 분석

1. 약물 제제(2가지 약물에 대한 3중 조건)
   참고: 템플릿에 대해서는 그림 1A를 참조하십시오.
   1. 별도의 96웰 플레이트에 125μL의 7H9-C 배지를 B2부터 G10까지 추가합니다.
   2. 4.2.4단계에서 희석을 설명하기 위해 1mL의 7H9-C에서 원하는 가장 높은 최종 농도의 두 배로 두 가지 약물을 준비합니다.
   3. 각 약물 250μL를 웰 B11-C11-D11 및 E11-F11-G11에 각각 추가하여 3회 처리합니다.
   4. 멀티채널 피펫을 사용하여 B11-G11에서 B10-G10으로 125μL를 이동하여 테스트 약물을 2배로 연속적으로 희석합니다. 각 단계에서 5회 피펫팅하여 혼합합니다.
   5. 플레이트를 가로질러 컬럼에서 컬럼으로(오른쪽에서 왼쪽으로) 125μL를 계속 이동하고 컬럼 4 이후에는 멈춥니다.
   6. 컬럼 4를 혼합한 후 125μL를 폐기물 용기에 버립니다. 2열과 3열에는 배경(공백) 및 양성 성장 제어로 사용할 수 있는 약물이 포함되어서는 안 됩니다.
      메모: 또는 약물 라이브러리를 테스트하기 위해 그림 1B의 템플릿을 따르십시오. 각 96웰 플레이트는 단일 농도에서 58개의 약물을 수용할 수 있습니다. 4.2.4단계에서 반으로 희석되므로 원하는 최종 농도의 두 배를 사용하여 이 약물 플레이트를 준비합니다.
2. 약물 치료:
   1. Mtb에 감염된 대식세포(Mtb/대식세포 응집체)가 들어 있는 96웰 플레이트를 회수합니다.
   2. 다중 채널 피펫으로 모든 관련 웰(B2에서 G11까지)을 조심스럽게 디캔팅합니다. 이 작업을 2단계로 수행합니다: 먼저 플레이트를 기울이지 않고 150 μL를 제거한 다음 플레이트를 기울이고 피펫 팁을 웰의 하단 가장자리에 삽입하여 나머지 매체(~50 μL)를 제거합니다. Mtb/대식세포 응집체가 웰 바닥에 부착되어 있기 때문에 어떤 물질도 손실되지 않습니다.
   3. 100μL의 7H9-C 배지를 Mtb/대식세포 응집체가 포함된 플레이트의 모든 관련 웰(B2 - G11)에 부드럽게 추가합니다.
   4. 멀티채널 피펫을 사용하여 약물 함유 96웰 플레이트(단계 4.1)에서 감염 플레이트의 해당 웰로 100μL를 전달합니다.
   5. 밀봉된 백에 넣고 37°C에서 3일 동안 배양합니다.

5. Resazurin Microtiter Assay를 사용한 약물 효능 정량화

1. H₂O에서 0.8 mg/mL의 최종 농도로 레사주린 원액을 준비합니다.살균을 위해 0.22 μm 공극 크기의 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 통해 필터링합니다.
2. 레사주린 원액_H2O와 Tween-80(_H2O에 20% 용액)을 2:1:1 비율로 혼합하여 레사주린 작업액을 제조한다. 최종 농도는 0.4mg/mL 레사주린 및 5% Tween-80입니다.
3. 플레이트 리더를 사용하여 37°C에서 24시간 동안 30분마다 530nm 여기와 590nm 방출에서 형광을 판독하도록 프로그램을 설정합니다. 플레이트 리더를 37°C로 예열합니다.
4. 다중 채널 피펫을 사용하여 약물 처리된 플레이트의 모든 관련 웰(B2에서 G11까지)에 20μL의 resazurin 작업 용액을 추가합니다(단계 4.11).
5. 플레이트 리더에 플레이트를 놓고 5.3.
   단계에서 설정한 프로그램을 시작합니다. 메모: 대량의 분석 플레이트를 쉽게 처리할 수 있도록 37°C 인큐베이터에서 분석을 개발하고 24시간마다 단일 형광 판독을 수행하는 것으로 충분합니다. 이는 kinetic 및 incubation 기능이 있는 플레이트 리더에 액세스할 수 없는 사용자에게도 적용됩니다.

결과

그림 1: 약물 플레이트 레이아웃. (A) 4단계에서 사용된 약물 챌린지 플레이트의 예시 템플릿. 이를 통해 8개의 정의된 농도로 3중 웰에서 두 개의 약물을 병렬로 테스트할 수 있습니다. 대표적인 실험으로 각각 2μM와 2.5μM에서 시작하는 리팜피신(RIF)과 목시플록사신(MOXI)을 사용했습니다. (B) 단일 농도에서 58개 화합물의 테스트 가능성을 보여주기 위해 처리량 스크리닝을 위한 대체 템플릿도 제공됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
7시간 9	BD 디프코	271310	제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
미들브룩 OADC	BD 바이오사이언스	212351
틸록사폴	시그마	T8761	H2O에 20 % 스톡 용액을 준비하고 필터를 살균합니다.
D-판토텐산 헤미칼슘염	시그마	P5710	H2O에 24 mg/ml 원액을 준비합니다. 필터 살균
L-류신	MP 바이오메디컬	194694	H2O에 50 mg/ml 원액을 준비하고, 필터를 살균합니다.
하이그로마이신 B	EMD 밀리포어	400051	H2O에서 200 mg/ml 원액을 준비합니다.
Nalgene Square PETG 미디어 병	써모 피셔	2019-0030
RPMI 1640 미디어	하이클론	SH30027.01
소 태아 세럼	애틀랜타 바이오로직스	S12450H
L-글루타민	코 닝	MT25005CI
헤페스	하이클론	SH30237.01
Cytation 3 플레이트 리더	(주)바이오텍		모든 형광판 리더 및 현미경과 상호 교환 가능
Gen5 소프트웨어	(주)바이오텍		레자수린 전환의 기록 및 분석
리팜피신	피셔 사이언티픽	BP2679250	H2O에 10 mg/ml 스톡 용액을 준비합니다.
목시플록사신 염산염	아크로스 오가닉스	457960010	H2O에 10 mg/ml 스톡 용액을 준비합니다.
레사주린 나트륨 염	시그마	R7017	H2O에 800 μg/mL 스톡 용액을 준비합니다. 필터 멸균
트윈-80	피셔 사이언티픽	T164500	H2O에 20 % 스톡 용액을 준비하고 필터를 살균합니다.

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