검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 1일차
참고: BSL-2 실험실에서 조직 배양에 사용되는 멸균 층류 생물 안전 캐비닛에서 아래에 설명된 모든 단계를 수행하십시오.
- 실온에서 혈청 샘플을 해동하고 각 혈청 샘플 100μL를 멸균 튜브로 옮깁니다. 수조 또는 온도 조절이 가능한 온도 혼합기에서 30°C에서 56분 동안 가열을 비활성화합니다. 차가운 RPMI-10(10% 소 태아 혈청이 함유된 RPMI)을 사용하여 1:1에서 1:1,000 범위의 혈청 샘플을 10배 연속 희석합니다.
- 연속으로 희석된 혈청 시료 10μL를 멸균 96웰 V-바닥 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 혈청 샘플이 없는 RVP만 있는 RPMI-10과 RVP가 없고 혈청 샘플이 없는 RPMI-10의 두 가지 대조군 웰을 포함합니다. 각 혈청 샘플과 RPMI-10 대조군을 세 번에 걸쳐 설정합니다.
- -80°C 냉동고에서 뎅기열-1, 2, 3, 4 RVP를 꺼내 37°C 수조에서 해동합니다. 해동된 RVP를 즉시 얼음으로 옮깁니다. 각 혈청 샘플에 대해 약 170μL RVP(각 혈청 희석(1:1, 1:10, 1:100, 1:1,000)에 대한 RVP 10μL x 3웰 및 RVP만 있는 RPMI-10 각각에 대해 3웰 10μL x 3웰)을 얻습니다.
- 혈청 샘플이 들어 있는 96웰 V-바닥 플레이트의 각 웰과 RVP(혈청 없음) 제어 웰이 있는 RPMI-10에 10μL의 RVP를 피펫팅합니다. RPMI-10에만 RVP를 추가하지 마십시오(혈청 샘플 및 RVP 없음) 웰. 5-10회 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. RVP 대신 10μL의 차가운 RPMI-10을 각 저온 RPMI-10 전용(혈청 샘플 및 RVP 없음) 대조 웰에 추가합니다.
- 96웰 V-바닥 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 5% CO2가 있는 상태에서 37°C에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 96웰 V-바닥 플레이트가 배양되는 동안 생물 안전 캐비닛 표면을 70% 에탄올로 청소하고 UV 광선을 15분 동안 실행합니다.
- 인큐베이터에서 K562 세포의 완전히 합류하는 T75 플라스크를 제거하고, 멸균 5mL 피펫을 사용하여 세포를 잘 혼합한 다음, 5mL의 세포를 멸균 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
메모: K562 세포는 RPMI-10에서 유지되고 1 x 106/mL에서 계대배양됩니다.
- 멸균 15mL 코니컬 튜브에서 10μL 세포를 제거하고 10μL 트리판 블루와 혼합하여 세포 수를 계산합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하여 15mL 원추형 튜브에 있는 총 세포 수를 확인합니다.
- 10분 동안 ~1,200 x g의 세포가 있는 15mL 원뿔형을 원심분리하고, 상층액을 디캔팅하고, 80,000 cells/30 μL 배지(2.66 x 106 cells /mL) 농도로 따뜻한 RPMI-10에 세포를 재현탁합니다.
- 인큐베이터에서 96웰 V-바닥 플레이트를 제거하고(단계 1.6), 30μL의 K562 세포를 96웰 V-바닥 플레이트의 각 웰로 옮기고, 5-10회 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 96웰 V-바닥 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 5% CO2가 있는 상태에서 37°C에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
- 1시간 동안 배양한 후 인큐베이터에서 96웰 V-바닥 플레이트를 제거하고 ~1,200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 플레이트를 10% 표백제가 들어 있는 용기에 거꾸로 뒤집어 웰에서 매체를 디캔팅합니다.
- 125μL의 따뜻한 RPMI-10에 각 웰의 세포를 재현탁시켜 세척하고 피펫으로 철저히 혼합한 다음 ~1,200 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 플레이트를 10% 표백제가 들어 있는 용기에 거꾸로 뒤집어 배지를 디캔팅합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다.
- 세척 후 각 웰에 100μL의 따뜻한 RPMI-10을 추가하고 피펫과 위아래로 혼합한 다음 5% CO2가 있는 상태에서 37°C에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다.
2. 3일차
- 인큐베이터에서 100μL의 세포와 배지/웰이 들어 있는 96웰 V-바닥 플레이트를 제거하고 생물 안전 작업대로 옮깁니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰의 내용물을 혼합하고 세포와 배지를 96웰 U-바닥 플레이트 또는 사전 라벨링된 5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
- 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 중 100μL의 1% 파라포름알데히드(PFA)로 96웰 V-바닥 플레이트의 각 웰을 헹구고 2.1단계에서 96웰 U-바닥 플레이트 또는 라벨링된 5mL 폴리프로필렌 튜브의 각 웰로 옮겨 0.5% PFA/웰 또는 튜브의 최종 농도를 산출합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 철저히 혼합하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 인큐베이터에 30 분 동안 두어 세포를 고정합니다.
- 염색되지 않은 K562 세포를 실행하여 형광 설정과 함께 측면 및 전방 산란을 보정하여 유세포 분석기(예: 재료 표 참조)를 준비합니다. 필요한 유일한 형광 채널은 FL1이며, GFP는 세포에서 방출되는 유일한 형광이기 때문입니다. 각 샘플에서 ~30,000–50,000개의 세포를 획득합니다.
메모: RVP에 감염된 세포는 GFP의 존재로 인해 녹색 형광만 방출하고 다른 형광 채널이 필요하지 않기 때문에 단일 형광을 판독할 수 있는 모든 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 수집할 수 있습니다.
3. 데이터 분석
- 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석기에서 획득한 데이터를 분석합니다(Table of Materials(재료표 참조).
- FSC-A(전방 산란 – 면적) 대 FSC-H(전방 산란 – 높이)를 기준으로 첫 번째 게이트를 설정하여 단일 세포를 포함하고 자동 형광 이중항을 분석에서 제외합니다. 그런 다음 SSC-A(side scatter – area) 대 FSC-A를 기반으로 singlet-gated cell을 게이트하여 자가형광 파편을 배제합니다.
- SSC-A 대 GFP-A를 기반으로 GFP 발현을 위해 SSC-A 대 FSC-A 게이트 세포를 분석합니다. 혈청의 각 희석에 대한 GFP+ 세포의 비율을 측정하고 GFP+ 세포 주위에 게이트를 설정하여 샘플을 대조군
으로 만듭니다.
- 각 혈청 샘플 희석에 대한 GFP+ 세포의 평균 백분율을 측정하고 3배 웰에 있는 GFP+ 세포의 총 백분율을 3으로 나누어 웰을 제어합니다.
- 각 희석에 대한 혈청 샘플에서 GFP+ 세포의 평균 백분율을 RVP(혈청 샘플 없음) 대조군이 있는 RPMI-10 내 GFP+ 세포의 평균 백분율로 나누어 감염의 폴드 강화를 계산합니다.
- 그래프 접기 향상(y축) 대 희석(x축)을 사용하여 통계 분석을 수행한 후 다중 비교를 위한 Tukey의 사후 검정
을 수행합니다.
