톨 유사 수용체 신호 억제를 위해 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하는 분석

초록

출처: Yang, H., et al. 톨 유사 수용체 신호 억제제에 대한 식세포 면역 세포의 생체 활성 나노 입자 스크리닝. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 TLR(Toll-like receptor) 신호 전달을 억제하는 잠재적인 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하기 위한 리포터 세포 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드와 혼합된 지질다당류(LPS)를 리포터 단백질인 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP) 및 루시페라아제(luciferase)를 발현하는 리포터 대식세포에 도입하는 것을 포함합니다. 하이브리드에 의해 매개되는 LPS 유도 TLR 신호의 감소는 리포터 신호를 측정하여 결정됩니다.

프로토콜

1. 리포터 세포를 이용한 잠재적 TLR4 나노 억제제 스크리

닝

참고: TLR4 신호전달은 MyD88 의존 육상 TRIF 의존 경로를 모두 활용하기 때문에 광범위한 TLR 신호 경로를 포괄하는 기본 대상으로 선택됩니다. THP-1-XBlue 리포터 셀은 주로 NF-κB/AP-1 활성화를 검사하는 데 사용되며 THP-1-Dual 셀은 TRIF 의존 신호 전달로 인한 IRF 활성화를 위해 사용됩니다.

1. 스크리닝 전에 용량-반응 곡선을 생성하여 최적의 LPS 용량을 식별합니다.
   1. 작동 중인 LPS 용액을 R10 배지에서 0.01 - 100ng/mL의 최종 농도로 희석합니다(log10 스케일로 희석). 플레이트 디자인을 배치하고 96웰 둥근 바닥 배양 플레이트에서 희석합니다. 희석 후 각 웰에 최소 110μL의 용액이 있는지 확인하십시오.
   2. 진공 흡입기를 사용하여 세포 파종 플레이트에서 배양 배지를 부드럽게 제거합니다.
   3. 희석판(1.1.1)에서 제조된 R10 배지가 포함된 LPS를 샘플의 레이아웃에 따라 배양판으로 옮깁니다. 플레이트를 37°C(세포 배양 인큐베이터에서)에서 24시간 동안 배양합니다.
   4. 24시간에서 상등액(80μL/well)을 새로운 96웰 둥근 바닥 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 이러한 용액에 대해 즉시 비색 및/또는 루시페라제 발광 분석을 수행하거나 분석 개발 전에 4°C(몇 시간) 또는 -20°C(일)에 보관하십시오.
      메모: 플레이트 레이아웃의 디자인은 실험 및 데이터 분석을 위해 간단하고 명확해야 합니다. 각 조건에 대해 2-4번의 반복실험을 고려해야 합니다. 항상 음수 제어 그룹(LPS null)을 포함합니다. Dual cell은 대식세포로 분화된 후 NF-κB/AP-1 활성화의 배경이 상대적으로 높기 때문에 NF-κB/AP-1 활성화를 위해 THP-1-XBlue cell을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 NF-κB/AP-1 및 IRF 활성화를 모두 보고하기 위해 이중 셀을 사용하는 것이 가능합니다.
2. NF-κB/AP-1 활성화를 위한 비색 분석 및 IRF 활성화를 위한 루시페라제 발광 분석을 개발합니다.
   1. NF-κB/AP-1 활성화를 평가하기 위해 각 샘플의 상등액 20μL를 새로운 96웰 평면 바닥 배양 플레이트로 옮기고 180μL의 예열된 SEAP 기질 용액을 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 37 ° C에서 1-2 시간 동안 배양하여 색상 개발 (분홍색에서 진한 파란색)을 허용합니다. 플레이트 리더에서 655nm에서 흡수를 수집합니다.
      주의: 배양 시간은 발색에 따라 달라질 수 있습니다(30분에서 최대 야간 배양). 발색의 채도(O.D >3)를 피하면서 가장 어두운 색상의 광학 밀도(OD)가 1 이상에 도달할 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
   2. IRF 활성화를 분석하기 위해 각 샘플의 상등액 10μL를 96웰 투명하고 평평한 바닥 흰색 플레이트로 옮깁니다. 루시페라제 용액(50μL)을 추가하고 즉시 well.
      로 발광을 잘 수집합니다. 메모: 자동 주입 기능이 있는 발광 플레이트 리더를 사용하여 웰에서 웰로, 플레이트에서 플레이트로 발광 판독의 일관성을 보장하는 것이 좋습니다. 기질 용액을 수동으로 주입하는 경우 각 웰에 대해 일관된 배양 시간과 판독 설정을 보장하십시오.
3. 10ng/mL LPS 자극(1.1 기준)을 통해 다양한 펩타이드-GNP 하이브리드에 대한 스크리닝 분석을 수행합니다. 리포터 분석 개발을 위해 1.2에서 동일한 절차를 따릅니다.
   1. 원심분리 방법을 사용하여 펩타이드-GNP 하이브리드를 R10 배지에서 200nM로 농축합니다. 하이브리드 용액(10nM)을 18,000 x g에서 30분 동안 20부피 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 버립니다. 하이브리드(튜브 바닥에 있음)를 튜브에 모으고 PBS로 두 번 세척한 다음 하이브리드를 R10 배지 한 부피에 다시 현탁시킵니다.
   2. 농축된 하이브리드와 R10 배지를 함유하는 LPS(20ng/mL)를 동일한 부피로 혼합하여 하이브리드와 LPS의 최종 농도가 각각 100nM 및 10ng/mL가 되도록 합니다.
   3. 배양된 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 혼합 용액 100μL를 각 웰에 추가합니다(각 조건에 대해 3회 반복). 음성 대조군(배지만 해당) 및 LPS 대조군(하이브리드가 없는 10ng/mL LPS)을 포함합니다.
   4. 37°C에서 24시간 배양 후 각 웰의 매체를 튜브로 옮기고 18,000 x g, 4°C에서 30분 동안 튜브를 원심분리합니다.상층액(50-80μL/튜브)을 96웰 원형 바닥 플레이트에 수집하고 3.2.
      에 설명된 대로 리포터 분석을 수행합니다. 주의: 원심분리 후 상등액을 버릴 때 튜브 바닥에 있는 하이브리드를 교반하지 마십시오.
      메모: 1.3.4 단계의 원심 분리는 배양 배지에서 내부화되지 않은 나노 입자 하이브리드를 제거하는 데 매우 중요하며 하이브리드와 비색 / 발광 판독 값의 간섭을 피할 수 있습니다. 이는 금 나노 입자가 크기와 응집에 따라 넓은 파장의 빛을 흡수할 수 있기 때문입니다.

2. 잠재적 후보의 억제 효과 검증

참고: 스크리닝에서 잠재적 후보의 억제 효과를 확인하기 위해 두 가지 접근 방식이 사용됩니다. 하나는 고정된 하이브리드 농도(또는 그 반대)에서 각성제(LPS)의 용량 반응을 검사하는 것입니다. 다른 하나는 면역 블로팅을 통해 NF-κB/AP-1 및 IRF3 신호의 억제를 직접 살펴보는 것입니다.

1. 접근법 1에서는 1.3에 설명된 것과 동일한 절차에 따라 100nM의 선도 하이브리드와 1ng/mL 및 10ng/mL에서 2개의 LPS 농도로 리포터 분석을 수행합니다. 비교를 위해 비활성 하이브리드(스크리닝 결과에 따라)를 하이브리드 대조군으로 포함합니다.
2. 면역 블로팅 접근법의 경우 표준 실험 절차를 따르십시오.
   1. R10 배지에서 THP-1 세포를 배양하고, 세포를 12-well 배양 플레이트(2 x 10⁶ cells/well)에 파종하고, 세포를 50ng/mL PMA로 24시간 동안 처리한 후 2일 동안 휴지하여 대식세포로 분화합니다.
   2. 세포 분화 후, 시간이 지남에 따라(최대 4시간) 하이브리드(100 nM)의 유무에 관계없이 10 ng/mL LPS로 세포를 자극합니다. 다양한 시점(0, 5, 15, 30, 60, 120, 240분)에서 면역블로팅을 위해 세포 용해물을 준비합니다. 비활성 하이브리드를 컨트롤로 포함합니다.
   3. IκBα, 인산화된 p65 및 인산화된 IRF3의 신호를 조사하여 NF-κB 및 IRF3의 활성화에 대한 선도 하이브리드의 억제 효과를 조사합니다. β-액틴 및 총 IRF3 신호를 내부 대조군으로 조사합니다.
      메모: 신호 전달은 종종 리포터 효소 SEAP 및 루시퍼라아제(24시간)의 발현보다 훨씬 빠르게(몇 시간 내에) 발생합니다. 또 다른 검증 방법으로 24시간에 테스트된 하이브리드의 생존력 분석을 수행하는 것이 좋습니다.

3. TLR 특이성 평가

참고: 선도 펩타이드-GNP 하이브리드의 TLR 특이성을 조사하기 위해 TLR2, TLR3 및 TLR5를 포함한 다른 TLR 신호 경로를 테스트합니다. TLR7, 8 및 9는 THP-1 유래 대식세포가 대식세포에서 TLR7, 8 및 9 발현이 부족하기 때문에 이러한 TLR의 자극에 잘 반응하지 않기 때문에 제외됩니다.

1. 1.1 및 1.2에서 동일한 절차에 따라 최적의 농도를 얻기 위해 두 리포터 세포 유래 대식세포에서 TLR2(Pam3CSK4), TLR3(poly I:C) 및 TLR5(편모)에 특이적인 리간드의 다양한 농도(1ng/mL - 25μg/mL)를 테스트합니다.
2. 3.1에서 얻은 농도로 납 하이브리드(100nM)와 각 TLR 리간드의 혼합물로 세포를 처리하여 1.3에 설명된 실험 절차에 따라 리드 하이브리드의 억제 특이성을 평가합니다. 비교를 위한 컨트롤로 비활성 하이브리드를 포함합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
THP-1-XBlue 리포터 셀	인비보젠	thpx-sp	세포 배양 통로를 20 미만으로 유지
THP-1-듀얼 레포터 셀	인비보젠	THPD-NFIS	세포 배양 통로를 20 미만으로 유지
RPMI-1640 (L-글루타민 없음)	GE 헬스케어	SH30096.02	사용하기 전에 37°C까지 예열하십시오. 완전한 미디엄 R10을 만들기 위해 보충제를 추가하십시오.
소 태아 세럼 (자격)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12484028	열 비활성화, RPMI-1640에서 10%
L-글루타민	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	완전한 매체 R10에서 2mM
나트륨 피루브산	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제11360-070	완전한 매체 R10에서 1mM
Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 1X, 칼슘 없음, 마그네슘	GE 헬스케어	SH30028.02	세포 세척 및 시약 준비에 사용
QUANTI-블루	인비보젠	렙-QB1	SEAP 기판
콴티-뤽	인비보젠	렙-qlc2	루시페라제 기판
제오신	인비보젠	개미 Zn-1	리포터 세포를 위한 선별 항생제
블라스티시딘	인비보젠	안티 BL-1	리포터 세포를 위한 선별 항생제
분자 생물학을 위한 디메틸 설폭사이드(DMSO)	시그말-알드리치	D8418-100ML	시약 준비에 사용
대장균 K12에서 추출한 지방다당류(LPS)	인비보젠	TLRL-EKLPS	TLR4 리간드
S. Typhimurium(FLA-ST)의 편모, 초순수	인비보젠	TLRL-엡스트플라	TLR5 리간드
SpectraMax Plus 384 마이크로플레이트 리더	분자 장치	해당 사항 없음	비색 분석 읽기
인피니트 M200 Pro 멀티모드 마이크로플레이트 리더(인젝터 포함)	테칸	해당 사항 없음	luminiscience 읽기
Costar 분석 플레이트, 투명하고 평평한 바닥이 있는 96웰 화이트, 조직 배양 처리	코닝 코스타	3903	발광 분석에 사용

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