동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 장기 격리
참고: 바이러스는 실온(RT)에서 안정적이지 않으므로 바이러스 역가를 보존하기 위해 한 번에 수확하는 동물의 수를 신중하게 계획해야 합니다.
- 필요한 표현형에 따라 선택한 용량과 경로를 사용하여 마우스를 감염시킵니다. 이 프로토콜의 경우 8-10주 된 수컷 및 암컷 I형 인터페론 수용체 결핍(Ifnar1-/-) C57BL/6 마우스를 감염시킵니다.
- Ifnar1-/- 마우스를 케타민(90mg/kg)과 자일라진(10mg/kg) 칵테일로 마취합니다. 마취를 확인하기 위해 단단한 발가락 꼬집기로 페달 반사를 테스트합니다. 발판을 통해 50μL의 ZIKV의 1 x 105 FFU(Focus forming Unit)를 피하(SC)로 투여합니다.
- 도구 소독을 위해 50mL 원뿔형에 가위 2개, 집게, 70% 에탄올(EtOH) 20mL를 수확하기 전날 수확에 필요한 모든 재료를 준비합니다.
- 주사기 및 바늘 준비: 관류용 주사기 20mL, 바늘 23G(케이지당 약 1개), 바늘 25G(마우스 3-5마리당 1개)가 있는 1mL 주사기. 튜브의 무게를 측정하기 전에 강철 비드(후드 내)를 1.5mL O-링 스크류 캡 튜브(각 장기에 1개)에 추가합니다. 튜브는 균질화에 적합해야 합니다.
- 추수하는 날, 관류와 장기 동결에 필요한 재료를 준비하십시오.
- 얼음 양동이에 드라이아이스와 EtOH 70%를 채워 얼음 목욕을 만듭니다. 각 관류에 대해 마우스 당 25-30mL의 PBS가 필요하다고 가정하고 척수에 대해 5-10mL가 필요하다고 가정하여 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. 마취제, 케타민과 자일라진의 칵테일을 얻고 마우스당 300μL를 가정합니다. 유세포 분석 등에 필요한 모든 재료와 추가 튜브를 보조 용기에 넣어 동물 시설로 운송합니다.
- 동물 시설에 출입할 때 개인 보호 장비를 착용하고 벗는 등 입국에 필요한 모든 절차를 따르십시오.
주의: 모든 절차는 생물안전성 2등급 실험실(BSL-2) 시설 내의 인증된 생물안전성 캐비닛에서 수행되어야 합니다.
- 동물의 크기와 체중에 따라 복강내로 200-500μL의 마취를 투여합니다. 혼자 일하는 경우, 장기 적출 전에 동물을 죽이지 않도록 한 번에 한 마리의 동물에게 마취를 투여한다.
- 페달 반사를 평가하기 위해 집게로 발가락을 꼬집어 마취 복용량을 확인합니다. 완전히 응답하지 않는 한 계속하지 마십시오. 핀을 사용하여 마우스를 왁스 보드에 고정합니다. 이 시점에서 장기 적출 절차에서 모발 오염을 방지하기 위해 마우스에 70% 에탄올을 담그십시오.
- 심장 천자에 의한 말기 출혈.
- 가위와 집게를 사용하여 흉강을 통해 동물을 열어 심장을 노출시킵니다. 심장 천자(~800 μL)를 통해 혈액을 채취하며, 이는 임상 화학, 혈액학, 항원 특이적 반응을 검출하기 위한 유세포 분석, 바이러스 복제 수 분석을 위한 실시간 정량 PCR(qRT-PCR)을 포함한 여러 분석에 사용할 수 있습니다.
- qRT-PCR에 의한 바이러스 RNA 분석의 경우, 전혈에서 추출하는 경우 EDTA 튜브에서 혈액을 수집하고, 혈청에서 추출하는 경우 미세 원심분리기 튜브에서 혈액을 수집합니다. (세럼의 경우 상온의 원심분리기에서 최대 속도로 튜브를 20분 동안 돌린 후 별도의 튜브에 세럼을 제거합니다.) 완료 후 선형 폴리아크릴아미드를 혈청 샘플에 담체로 추가합니다. 그런 다음 RNA를 분석하거나 -80°C에서 저장하여 나중에 추가로 처리할 수 있습니다.
- 실온(또는 37°C)에서 20mL 주사기에 PBS를 채우고 나비 바늘을 좌심실에 삽입하여 마우스를 관류합니다. 혈액과 PBS가 빠져나갈 수 있도록 오른쪽 심방에 구멍을 뚫습니다. PBS를 천천히 투여하면서 간의 색을 확인하여 동물이 완전히 관류되었는지 확인합니다. 간은 짙은 빨간색에서 분홍색 연어 색으로 변해야 합니다.
- 조직학을 위해 장기를 준비하는 경우 나비 바늘을 제자리에 두고 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 20mL를 관류합니다. 그렇다면 두 주사기가 모두 부착된 3방향 마개에 주사기를 연결하고 PBS와 PFA를 번갈아 가며 밸브를 켜고 끄는 것이 편리합니다.
- 장기를 라벨이 붙고 무게가 달린 튜브에 채취합니다. 말초 장기의 경우 수확을 위해 확립된 순서(간, 비장, 신장 및 폐)를 따릅니다.
- 간에서 단지 하나의 엽을 취하십시오; 어느 쪽이든 상관 없지만, 모든 실험에 대해 항상 같은 크기의 조각을 가진 동일한 엽을 취하려고 노력하십시오. 마찬가지로 신장과 폐의 경우 동일한 신장과 폐를 사용하십시오. 유세포 분석도 완료해야 하는 경우 모든 장기를 반으로 줄일 수 있습니다. 세포 분석에 사용할 절반을 수확이 완료될 때까지 실온의 RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium)에 보관하십시오.
- 수확 직후, 각 장기를 라벨이 붙은 튜브에 넣고 드라이아이스 수조에 넣습니다. 바이러스 역가는 실온에서 시간이 지남에 따라 감소하므로 장기를 적출하는 데 걸리는 시간이 매우 중요합니다. 마우스 간에 일관성이 있어야 하므로 안전 다음으로 우선 순위는 속도입니다.
메모: 바이러스 역가를 위해 장기를 적출하는 경우, 이 시점에서 두 번째 개체가 뇌를 적출하여 바이러스 역가를 보존하는 것이 매우 도움이 됩니다.
- 척추와 두개골에 접근하기 위해 쥐의 체강에서 나머지 장기를 제거합니다.
- 보드에서 마우스를 제거하고 가죽을 제거한 다음 팔과 다리를 제거합니다.
참수, 둔기 또는 수술 용 가위로 마우스의 머리를 제거하고 톱니 모양의 LaGrange 가위로 두개골을 잘라 뇌를 적출합니다. 그런 다음 집게로 두개골을 벗겨내고 주걱으로 뇌를 퍼냅니다.
- 강하고 뭉툭한 가위를 사용하여 척추를 둘러싼 갈비뼈와 다른 뼈를 제거합니다. 그런 다음 골반 뼈를 가로질러 잘라 요추 수준에서 척추 구멍을 노출시킵니다. 이 시점에서 척수의 작은 끝이 보여야 합니다.
- PBS로 채워진 10mL 주사기와 18G 바늘을 사용하여 페트리 접시를 통해 요추에서 경추까지 탯줄을 "플러시"하여 척수를 배출합니다.
- 바늘의 비스듬한 끝을 척추공 내부에 조심스럽게 넣고 바늘이 척추체를 침범하는 것을 방지하기 위해 과도한 압력을 피하십시오. 강하게 잡아 척추체와 바늘에 압력을 가하고 주사기 플런저를 눌러 탯줄을 배출합니다. 즉시 척수를 라벨이 붙은 튜브로 옮기고 드라이아이스 욕조에 넣으십시오.
- 수확이 완료될 때까지 모든 동물에 대해 절차를 반복합니다. 수확 도구를 70% 에탄올에 넣고 동물을 사이에 둡니다. 일관성과 속도에 중점을 둡니다. 각 장기 적출 사이의 시간은 바이러스 역가 결과에 편향되지 않도록 일정하게 유지되어야 합니다.
- 완료되면 동물 시설에서 제거하기 전에 생물 안전 캐비닛과 모든 재료를 소독하십시오.
- 얼음 수조에서 각 튜브를 제거하고 튜브의 무게를 측정하여 장기 무게를 결정합니다. 장기의 무게를 결정하려면 장기 함유 튜브의 무게에서 빈 튜브의 무게를 뺍니다.
참고: 이 시점에서 장기를 -80°C에서 동결하여 나중에 추가 처리하거나 개별 부분 표본을 동결하기 직전에 장기를 균질화할 수 있습니다. 샘플을 여러 번 동결-해동하면 바이러스 역가가 감소합니다. 따라서 단일 프로젝트 내의 모든 실험에 대해 동일한 절차를 수행하는 것이 중요합니다.
2. 장기 균질화
- 균질화할 각 장기에 대해 3개의 라벨링된 1.5mL 스냅 캡 튜브를 준비합니다.
- 수확 직후 샘플이 균질화되지 않는 경우 -80 °C에서 튜브를 제거합니다. 균질화를 위해 샘플을 해동할 필요가 없습니다.
- 바이러스 역가 손실을 최소화하기 위해 샘플을 얼음 위에 올려 차갑게 보관합니다. 그런 다음 각 장기 함유 튜브에 5% FBS가 함유된 저온 DMEM 1mL를 추가합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 비드 비터에서 튜브를 즉시 치십시오. bead-homogenizer 기기에서 강철 비드로 모든 장기를 균질화합니다. 각 장기가 완전히 균질화되었는지 확인하십시오.
- 8°C로 냉각된 마이크로fuge에서 5분 동안 12,000 x g의 마이크로fuge로 장기 파편을 회전시킵니다. 그런 다음 튜브를 얼음 양동이에 다시 넣습니다. 생물 안전성 캐비닛에서 필요한 분석을 위해 샘플을 튜브로 분주합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 양동이에 다시 넣습니다.
- 초점 형성 분석의 경우 500μL를 표지된 튜브로 분취합니다. 그런 다음 얼음 양동이의 랙에 튜브를 놓습니다. 바이러스 게놈 복제 수를 측정하기 위해 qRT-PCR(fluorogenic quantitative RT-PCR)을 위한 RNA용 튜브에 50μL를 분주합니다.
- 상용 RNA 분리 키트를 사용하여 감염된 동물의 장기에서 전체 RNA를 분리합니다. 각 플라비바이러스 게놈에서 고유한 염기서열을 인식하는 ZIKV에 특이적인 프라이머-프로브 세트를 사용하여 플라비바이러스 바이러스 RNA를 측정합니다. ZIKV 표적 염기서열을 포함하는 T7 중합효소를 사용하여 in vitro에서 생성된 정의된 positive single-stranded RNA를 포함하는 복제 제어 플라스미드를 사용하여 바이러스 복제 수를 측정합니다.
- 약 300μL인 나머지 샘플을 세 번째 튜브에 분취하고 필요한 경우 -80°C에서 보관합니다.
참고: 샘플이 이전에 동결되지 않은 경우 -80 °C에서 동결하십시오. 샘플이 이전에 동결된 경우 중지하기 전에 초점 형성 분석 및/또는 RNA 분리를 계속하십시오.
3. 지카 바이러스 포커스 포밍 분석
참고: 바이러스 없는 통제와 양성 통제를 포함하는 것이 중요합니다. 양성 대조군은 알려진 농도를 가진 바이러스 스톡의 희석 계열입니다. 모든 대조군이 동일한 플레이트에 있을 필요는 없지만 분석이 5개의 플레이트보다 커지면 더 많은 대조군을 추가하고 플레이트 간에 분산해야 합니다. 피펫 팁이나 세게 세척하여 단층을 긁지 않도록 주의하십시오. 여러 장기가 같은 날 또는 다른 날에 역가를 투여할 수 있습니다. 그러나 다양한 분석 조건이 바이러스 역가에 영향을 미칠 수 있으므로 개별 장기를 며칠에 걸쳐 역가를 수행해서는 안 됩니다. 하루에 개별 장기를 실행하는 것이 좋습니다.
- 분석 당일에 앞서 초점 형성 분석에 필요한 세포와 시약을 준비합니다.
- 500mL의 DMEM과 5mL의 HEPES 및 25mL의 FBS를 함유하는 성장 배지를 준비합니다. 분석 시작 전에 37°C, 5%CO2의 성장 배지에서 성장하는 Vero-World Health Organization(WHO) 세포가 있어야 합니다. Vero 세포는 높은 계대가 아니어야 하며 분석이 시작되기 전에 100% 포화도 이상으로 성장한 적이 없어야 합니다.
- 10g의 메틸셀룰로오스가 든 1L 유리 매체 병과 큰 교반 막대, H2O500mL가 있는 별도의 1L 유리 매체 병을 고압멸균하여 2% 메틸셀룰로오스 용액 500mL를 준비합니다. 오토클레이브 물이 냉각되면 병을 만졌을 때 뜨거워지지만 끓지 않을 때까지 전자레인지에서 다시 가열합니다.
- 조직 배양 후드에 있는 동안 메틸셀룰로오스 병에 따뜻한/뜨거운 물을 부드럽게 붓습니다. 병의 뚜껑을 부분적으로 닫고 메틸셀룰로오스가 용액(1-4시간)에 들어갈 때까지 핫플레이트를 저어줍니다. 2% 메틸셀룰로오스 용액을 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 분취합니다. 2% 메틸셀룰로오스는 필요할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 플레이트를 고정하기 위해 PBS에 5% 파라포름알데히드 용액을 준비하고 필요할 때까지 4°C에서 보관합니다. PBS에 0.05% Triton X-100을 첨가하여 1x 초점 형성 분석 세척 완충액을 준비하고 RT에 보관합니다. PBS에 1mg/mL 사포닌을 첨가하여 1x FFA 염색 완충액을 준비하고 필요할 때까지 4°C에서 보관합니다. 이것들은 1-2주 전에 준비할 수 있습니다.
- 각 장기가 3회씩 도금되도록 분석에 필요한 바닥이 평평한 96웰 플레이트의 수를 계산합니다. 양성 및 음성 대조군을 위한 충분한 추가 웰을 포함합니다.
- 설계된 분석을 완료할 수 있도록 성장 배지에서 충분한 Vero 세포를 성장시킵니다. Vero 세포를 트립신화하고 계수하여 성장 배지에서 mL당1.5 x 10 5 세포로 재현탁합니다. 웰당 200μL를 추가하여 성장 배지에서 3.0 x 104 Vero-WHO 세포/웰의 96웰 평면 바닥 플레이트에 있는 플레이트 Vero 세포.
- 37°C에서 5% CO2로 플레이트를 하룻밤 동안 배양하고, 플레이트가 인큐베이터에서 수평을 유지하여 세포가 웰 내에 균등하게 분포되도록 합니다.
참고: 각 실험실은 Vero 세포를 약간 다르게 성장시킵니다. 목표는 지카 바이러스에 대한 분석 당일 각 웰에서 90-95% 융합 단층입니다.
- 분석 당일에 지카 바이러스 샘플을 희석합니다. 장기 샘플이 이전에 균질화된 경우 -80°C 냉동고에서 샘플을 제거하고 해동시킨 후 분석을 위해 샘플을 얼음에 놓습니다.
- 얼음 위에서 B열부터 H열까지 180μL의 저온 성장 매체를 추가하고 A열을 비워 두어 둥근 바닥 96웰 플레이트를 준비합니다. 균질화된 각 장기 샘플 150μL를 둥근 바닥판의 A열에 추가합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 각 샘플의 연속 10배 희석액을 준비합니다. 180μL의 성장 배지에 20μL의 시료를 첨가하고 각 희석 사이에 피펫 팁을 변경하여 둥근 바닥 96웰 플레이트에서 시료를 희석합니다.
- Vero 세포를 덮고 있는 평평한 바닥 96웰 플레이트에서 배지를 제거하여 초점 형성 플레이트를 준비합니다. 단층이 건조되는 것을 방지하기 위해 바이러스 샘플을 추가하기 직전에 이 작업을 수행하십시오.
- Vero 플레이트의 각 웰에 바이러스 희석 100μL를 추가합니다. 동일한 팁 세트를 사용하여 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도로 이동하여 샘플을 추가합니다. 암판을 좌우로 2-4회 돌리지 않도록 주의합니다.
- 37 ° C, 5 % CO2에서 1-2 시간 동안 배양합니다.플레이트가 인큐베이터 내에서 수평인지 확인하십시오. 배양 중에 2% 메틸셀룰로오스를 RT로 예열합니다.
- 성장 매체에 2% 메틸셀룰로오스 용액을 희석합니다. 희석액은 성장 배지에 대한 약 2% 메틸셀룰로오스의 약 2:1의 비율이어야 합니다. 사용할 때가 될 때까지 실온으로 유지하십시오. 메틸셀룰로오스: 성장 배지 1-2방울/웰(피펫을 125μL로 설정)을 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 37 ° C, 5 % CO2에서 32-40 시간 배양하십시오. 모든 사람의 베로 세포는 조금씩 다르게 성장하기 때문에 세포 포화도 및 지카 바이러스의 균주와 같은 요인에 따라 잠복 시간이 바뀔 수 있습니다.
- 준비된 5% 파라포름알데히드 용액을 사용하여 Vero 세포를 고정합니다.
- 생물 안전성 캐비닛의 메틸셀룰로오스 층 상단 위에 각각 50μL의 5% 파라포름알데히드를 추가합니다. RT에서 60분 동안 배양합니다. 고정은 4 °C에서 밤새 갈 수 있지만 증발을 줄이기 위해 파라 필름으로 플레이트를 덮습니다.
- 오버레이와 배지를 세포에서 추출하여 생물 안전 캐비닛 내부의 폐기 용기에 넣습니다. PBS, 150 μL/well로 부드럽게 세척합니다. 플레이트에서 PBS를 제거하고 BSL-2에서 플레이트를 제거합니다.
- PBS 세척을 2회 반복하여 150μL/웰을 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거합니다. 150 μL/well 1x FFA 세척 버퍼를 추가하고 RT에서 5-10분 동안 그대로 두어 고정 세포를 투과시킵니다.
- 1차 지카 항체를 사용하여 감염을 감지합니다. FFA 염색 완충액에서 1μg/mL 농도의 1차 항체 4G2(D1-4G2-4-15)를 준비합니다. 전체 분석에 충분한 항체를 준비합니다.
메모: 실험실 기저귀 또는 기타 보푸라기가 많은 흡수성이 높은 물질은 섬유가 병소의 이미징에 부정적인 영향을 미치므로 멀리하십시오.
- 플레이트에서 FFA 세척 버퍼를 제거합니다. FFA 염색 완충액에 1차 항체 50μL/well을 추가합니다. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 흔들리는 플랫폼에서 4°C에서 밤새 배양합니다. 분석은 RT에서 2시간 동안 배양으로 수행할 수 있습니다.
- 2차 HRP 접합 항체를 추가하여 감염을 시각화합니다. FFA 염색 완충액에서 1:5,000 농도의 2차 Goat 항 마우스 HRP 표지 항체를 준비합니다. 전체 분석에 충분한 항체를 준비합니다.
- FFA 세척 버퍼로 셀을 3번 세척하고 매번 싱크대에 튕겨 세척 버퍼를 제거합니다. FFA 염색 완충액의 2차 항체로 세포를 50μL/well에서 염색합니다. RT에서 1-2 시간 배양하십시오.
- FFA 세척 버퍼로 셀을 3번 세척하고 매번 싱크대에 튕겨 세척 버퍼를 제거합니다. 50 μL/well의 Trueblue 기판을 추가합니다.
- 플레이트를 주의 깊게 관찰하고 반점이 완전히 정의되고 배경이 최소화될 때까지 2-15분 동안 기다립니다. 반점이 보이면 손으로 물로 부드럽게 씻어 물이 흐르는 힘으로부터 단층을 보호하십시오. 종이 타월(기저귀 아님)을 두드려 말리고 가능한 한 빨리 이미지를 이미지
화하십시오.
- 스팟은 수동으로 또는 자동화된 스팟 카운터를 사용하여 계수할 수 있습니다. 수동으로 계산하는 경우 분석 범위를 사용하여 시각화를 지원할 수 있습니다.
- 각 샘플에 대해 쉽게 구별할 수 있는 병소(예: 웰당 20-200)가 있는 희석액을 선택하고 중복된 웰의 평균을 사용하여 mL당 초점 형성 단위(FFU/ml)로 역가를 계산합니다: FFU/mL = (평균 초점/웰) ×(희석 계수) ÷(mL 접종물).
