기계감각수용체에 대한 항체로 처리된 혈소판에 대한 전단 응력의 영향

초록

출처: Quach, M. E. et al., 원뿔판 점도계를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용체에 대한 균일한 전단 분석. J. Vis. 특급.(2019년)

이 비디오는 전단 응력이 혈소판에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. 항체 처리는 기계수용체 복합체의 해리 및 구조적 변화를 유도하여 혈소판을 활성화하고 표면의 마커를 발현합니다. 이러한 마커는 면역염색 및 유세포 분석을 통해 관찰됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 채혈 및 혈소판 분리

1. 실험 당일 정맥 천자를 통해 동의한 건강한 성인 기증자로부터 인간의 혈액을 3.8% 구연산삼나트륨으로 채취합니다. 4.5mL 혈액 튜브 1개는 혈소판 수가 μL당 250 x 10³에 가까운 기증자의 20-25가지 조건에 대해 충분한 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 생성하기에 충분합니다.
   메모: 협궤 바늘(21G 미만)을 통해 혈액을 채취하지 마십시오.
2. 긴 브레이크로 22°C 및 140 x g에서 12분 동안 원심분리를 통해 PRP를 준비합니다. 이로 인해 적혈구가 아래쪽에, 밝은 색의 PRP가 위쪽에 있는 두 개의 뚜렷한 층이 생성됩니다.
3. 45° 각도로 절단된 피펫 팁을 통해 조심스럽게 피펫팅하여 PRP의 상단, 흐린 노란색 층을 분리하고 완전 혈구 수(CBC)를 통해 혈소판 수를 얻습니다.
4. 필요한 경우, 프로스타글란딘 E1(PGE1)이 있는 상태에서 1,4-피페라진디에탄설폰산 나트륨염(PIPES) 완충 식염수(150mM 염화나트륨, NaCl, 20mM PIPES)에서 혈소판을 세척하고 티로드의 완충액(134mM NaCl, 0.34mM 인산이나트륨, Na₂HPO₄, 2.9mM 염화칼륨, KCl, 1mM 염화마그네슘, MgCl₂, 5mM 포도당, 12mM 중탄산나트륨, NaHCO₃, 20mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, HEPES, pH 7.35)를 5mM 포도당과 함께 사용하지 않으면 1.5단계로 진행합니다. 다음 단계에서는 세탁에 대해 간략하게 설명합니다.
   1. PIPES-buffered saline을 사용하여 PRP 부피를 10mL로 조정하고 0.6μM PGE1을 추가합니다.
   2. 1,900 x g에서 8분 동안 원심분리기를 한 다음 상층액을 버리고 혈소판 펠릿을 400μL의 Tyrode 및 포도당 용액에 5분 동안 그대로 둡니다.
   3. 혈소판 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시키고 30분 동안 방해받지 않도록 합니다.
5. 풀링된 인간 혈소판 부족 혈장(PPP)을 사용하여 혈소판 수를 ~250 x 10 μL당³개의 혈소판으로 조정하고 현탁액을 방해받지 않고 또는 완만하게 회전하면서 22°C로 유지합니다.

2. 항체 및 균일 전단 처리

참고: 피펫팅이 필요한 섹션 2의 모든 단계는 전단이 발생하지 않도록 천천히 수행해야 합니다.

1. PRP 또는 세척된 혈소판에 원하는 항체를 추가하고 위아래로 피펫팅하거나 피펫 팁으로 저어주어 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 5-10분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 동일한 부피의 PPP 또는 Tyrode's buffer를 음수 대조군에 추가합니다.
2. 콘 플레이트 점도계를 켜고 플레이트 온도를 22°C로 설정하고 플레이트가 이 온도에 도달할 때까지 기다립니다.
3. 처리된 PRP 또는 세척된 혈소판을 플레이트 중앙에 있는 온도 제어 콘 플레이트 점도계에 직접 피펫팅합니다. 모든 샘플이 원뿔 가장자리 바깥쪽이 아닌 접촉 지점에서 원뿔과 플레이트 사이에 증착되었는지 확인하십시오.
4. 적절한 속도와 지속 시간으로 전단합니다.
   1. 점도계 설명서에 표시된 대로 또는 이전에 표시된 대로 전단을 계산합니다.
   2. 뉴턴의 점도 법칙을 통해 점도 및 원하는 전단 응력에서 전단 속도를 결정합니다. ; 플라즈마 점도는 1.5-1.6 센티푸아즈(cP)입니다. 예를 들어, 인간 순환에 대한 정상 전단 범위는 5-30 dyn/cm²이고 전단은 한 자릿수 분 시간 척도로 적용되어야 합니다.
5. 샘플이 플레이트와 콘 모두와 접촉한 상태를 유지하도록 플레이트에서 콘을 약간(~2mm) 들어 올리고 젤 로딩 또는 기타 긴 피펫 팁을 사용하여 샘플 부피의 중심에서 5-10μL를 수집합니다.
6. 전단된 샘플을 실온에서 20분 동안 원하는 마커로 배양합니다. 포스파티딜세린, β-갈락토오스 및 P-셀렉틴 노출 마커의 경우 각각 0.08μM의 락타데린 C2 도메인(LactC2), 6.25μg/mL의 에리스리나 크리스타갈리 렉틴(ECL) 및 항-P-셀렉틴 항체(20μg/mL)를 사용합니다.
7. 희석 또는 냉장 보관 전에 RT에서 20분 동안 2% 파라포름알데히드에 샘플을 고정하고 3.1단계를 진행하거나 4°C에서 12시간 이상 샘플을 보관합니다.

3. 유세포 분석을 통한 표면 마커 및 가교

검출

1. 유세포 분석을 통해 샘플을 분석하여 각 조건에 대해 최소 20,000개의 이벤트를 수집합니다.
2. 각 형광단의 강도에 대한 높이 값 또는 기하 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 형광 마커의 신호 강도를 정량화합니다.
3. 전단 처리 후 혈소판 가교를 감지하려는 경우, 이미징 기능이 있는 유세포 분석기에서 샘플을 분석하고 면적 및 종횡비 매개변수별로 가교를 정량화합니다.
   1. 면적 및/또는 종횡비의 히스토그램을 플로팅합니다.
   2. 소 혈청 알부민(BSA) 또는 비히클과 함께 음성 대조군을 사용하여 가장 완전한 원형 이벤트(이 게이트는 일반적으로 종횡비 ~0.8로 그려짐)를 제외한 게이트를 그리고 이 게이트 내부의 이벤트 비율을 정량화합니다. 가로 세로 비율이 낮은 이벤트는 교차 연결될 가능성이 더 높습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
APC 안티 휴먼 CD62P (P-Selectin)	바이오레전드	304910
Brookfield Cap 2000+ 점도계	브룩필드	-
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) (FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin, ECL)	벡터 랩스	플로리다-1141
풀링된 일반 인간 플라즈마	정밀 생물학	CCN-10
Vacutainer Light Blue 혈액 채취 튜브(구연산나트륨)	BD (영어)	369714
Vacutainer 혈액 채취 세트, 21G x 3/4" 바늘	BD (영어)	367287

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