대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

초록

출처: Sarkar, A., et al. 대식세포 내 성장의 정량화는 리슈마니아 기생충의 독성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법입니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 골수 유래 대식세포(BMM)에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포 세포는 각각 리슈마니아(Leishmania)의 운동성 및 비운동성 침습 단계(motile and non-motile invasive stages), 메타고리 전구세포(metacyclic promastigotes) 및 무산소세포(amastigotes)에 감염되어 있습니다. 기생충은 대식세포에 침입하여 기생 액포(parasitophorous vacuole)로 내면화되어 내부에서 증식합니다. 세포 내 기생충 성장은 대식세포와 기생충 핵을 형광 염색할 때 현미경을 사용하여 정량화합니다.

프로토콜

1. 감염을 위해 커버 슬립에 BMM 도금

1. 각 빈 웰의 바닥에 멸균 12mm 유리 커버슬립 4개(고압 멸균 및 밀폐된 유리 용기에 보관)를 배치하여 6웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다.
   메모: 각 멸균 12mm 커버슬립을 진공 라인에 장착된 흡입 팁으로 선택합니다. 커버슬립을 겹치지 않게 웰에 놓고 튜브를 꼬집어 진공을 중단하여 원하는 위치에 놓습니다.
2. 부착 골수 유래 대식 세포로 코팅 된 Petri 접시의 배지 (및 비 부착 세포)를 흡인하고 부착 세포를 37 ° C로 예열 된 칼슘 및 염화마그네슘이 없는 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS -/-)로 2x 부드럽게 헹굽니다.
3. 최종 농도가 1mM EDTA인 5mL 멸균 1x PBS -/-를 각 페트리 접시에 적가하고 37°C에서 5분 동안 배양하여 부착성 BMM을 분리합니다.현미경을 사용하여 세포가 분리되었는지 확인합니다.
4. 50mL 원뿔형 튜브에 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 보충된 1x PBS에 현탁된 모든 분리된 세포를 수집합니다. 각 접시를 5mL PBS -/-로 2회 헹구고 세포 현탁액 풀에 추가합니다.
   메모: 세....

결과

그림 1: L. amazonensis의 악성 axenic amastigotes(A) 및 non-virulent log-phase promastigotes(B)를 사용한 BMM 감염의 대표적인 그림. BALB/c 마우스에서 분리된 대식세포의 면역형광 이미지, 감염 후 1시간 및 48시간. 감염된 대식세포는 프로토콜에 기술된 대로 면역형광을 처리하였다. PV 멤브레인을 1시간 동안 rat anti-mouse Lamp1 단일클론 항체(1:1,000 희석)로 염색한 후 anti-rabbit 형광 IgG(1:500 희석)로 1시간 배양했습니다. 기생충 염색은 axenic L. amazonensis amastigotes에 대해 생성된 마우스 다클론 항체로 커버슬립을 배양한 후 항마우.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 세포 배양 플레이트	(주)셀스타	657160
아데닌	아크로스 오가닉스	AC147440250
에어로졸 배리어 피펫 팁(100-1000 μL)	피셔브랜드	02-707-404
에어로졸 배리어 피펫 팁(20-200 μL)	피셔브랜드	02-707-430
에어로졸 배리어 피펫 팁(2-20 μL)	피셔브랜드	02-707-432
Bard-Parker 립백 탄소강 수술용 블레이드 #10	아스펜 서지컬	371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL 주사기	벡턴 디킨슨(BD)	309604
BD 프리시전글라이드 니들, 25G	벡턴 디킨슨(BD)	305124
세포 배양 접시 35mm x 10mm	(주)셀스타	627 160
세포 배양 플라스크	(주)셀스타	660175
커버 안경 : 12mm 서클	피셔브랜드	제12-545-80
DAPI (4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)	인비트로젠	D1306 (영어
D-비오틴	J.T. 베이커	C272-00
에디타	시그마 알드리치	EDS (에디에스)
에틸 알코올 200 프루프	팜코-AAPER	111000200
Falcon 100mm x 15mm 비 TC 처리 폴리스티렌 페트리 접시	코 닝	351029
소 태아 세럼	세라딤	1500-500
파이콜400	시그마 알드리치	F8016
형광 현미경	니콘	200회
염소 안티 마우스 IgG 텍사스 레드	인비트로젠	T-862
염소 안티 토끼 IgG AlexaFluor488	인비트로젠	A-11034
헤민	도쿄 화학 공업 주식회사	H0008
헤페스 (1M)	지브코	제15630-080
Isoton II 희석제	벡크만 쿨터	8546719
L-글루타민	쌍둥이자리	400-106
중간 199 (10X)	지브코	제11825-015
Na 피루브산 (100 mM)	지브코	제11360-070
파라포름알데히드	알파 에자르	43368
페니실린/스트렙토마이신	쌍둥이자리	400-109
인산염 완충 식염수 (-/-)	써모피셔	14200166
폴리프로필라인 원뿔형 원심분리기 튜브 15 mL	(주)셀스타	188 271
폴리프로필라인 원뿔형 원심분리기 튜브 50 mL	(주)셀스타	227 261
ProLong Gold 퇴색 방지 시약	써모피셔	P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 항체	발달 연구 Hybridoma Bank	1D4B
재조합 인간 M-CSF	페프로텍	300-25
Reichert Bright-Line 혈구계	Hausser 사이언티픽	1492
RPMI 미디엄 1640 (1X)	지브코	11875-093
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호 ) (영문) 년 호 년 호 호 년 명 명 년 년 년 년 년 호