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1. 박테리아의 준비
참고: 전체 세포 박테리아 기질과 정제된 펩티도글리칸은 마이크로슬라이드 확산 분석과 염료 방출 분석 모두에서 효소 기질로 사용됩니다. 이러한 기질은 효소 반응을 수행하기 전에 준비가 필요합니다. 다음 프로토콜은 준비에 대해 설명합니다.
- 전체 박테리아 세포 기질
- 영양액 500ml에 Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857)을 참조하십시오. 30°C에서 진탕(125rpm)으로 배양하여 배양액액이 급격한 성장 단계로 정의되는 기하급수적 성장 단계에 도달할 때까지 배양하여 박테리아 배양을 두 배로 늘립니다. Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708)의 배양을 위해 영양 육수를 37 °C에서 진탕(125 rpm)과 함께 성장 배지로 사용하십시오.
- 3기압의 압력에서 121°C에서 10분 동안 고압증기멸균하여 각 배양을 가열합니다.
- 열에 의해 사멸된 박테리아 기질을 5,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 수확합니다. 펠릿을 Type 1 물로 세 번 씻고 최소한의 물로 다시 현탁시킵니다. 이 연구에서는 기질을 1,200μl에 현탁시킵니다.
- 박테리아 세포 기질 300μl를 1.5ml 마이크로분리 튜브에 분취하고 20°C에서 보관합니다.
2. 기판 라벨링 - Remazol Brilliant Blue R 염료 라벨링
참고: 염료 방출 분석에서 기질은 Remazol brilliant blue R 염료에 공유 결합됩니다. 다음 프로토콜은 염색된 효소 기질의 제조를 설명합니다.
- 200mM Remazol Brilliant Blue R 염료(RBB) 용액을 만드는 데 사용할 Type I 물 99ml에 NaOH 1g을 용해시켜 250mM 수산화나트륨(NaOH) 용액을 만듭니다.
- 1.25g의 RBB를 98.75ml에 녹± 1ml의 신선한 250mM NaOH 용액을 만들어 200mM RBB 용액을 만듭니다.
- 30ml의 RBB 용액에 0.5g의 습식 중량 농도로 열에 의해 죽은 박테리아 세포를 다시 현탁시킵니다. 정제된 펩티도글리칸의 경우 펩티도글리칸을 RBB 용액 30ml에 0.3g 습식 중량의 농도로 다시 현탁시킵니다.
- 부드럽게 혼합하면서 37°C에서 6시간 동안 회전 플랫폼의 삼각 플라스크에서 반응 혼합물을 배양합니다.
- 반응 혼합물을 4°C 인큐베이터로 옮기고 부드러운 혼합으로 추가로 12시간 동안 배양합니다.
- 배양 후, 3,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 염색된 기질을 수확합니다. 기질 펠릿에서 염료 용액을 디캔팅합니다.
- 염료 표지된 세포 또는 펩티도글리칸을 Type I 물로 반복적으로(약 3-5회 세척) 세척한 후 원심분리하여 기질에서 공유 결합 된 용해성 염료를 제거합니다. 물을 추가할 때마다 펠릿을 완전히 다시 매달아 두십시오.
메모: 결합이 해제되면 용해성 염료는 원심분리 후 물 세척에서 더 이상 볼 수 없습니다. 기판은 한 번 더 세척해야 합니다. 기판은 파란색으로 유지되지만 마지막 세척의 상등액은 투명합니다.
- 염색된 기판을 -20°C의 최소량의 물에 현탁하여 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오.
3. 정량적 염료 방출 분석
참고: 염료 방출 분석 중에 효소 반응에서 RBB 염색 기질의 가수분해는 염색된 생성물을 반응 상층액으로 방출합니다. 방출된 염료의 양에 대한 비색 측정은 주어진 효소에 대해 샘플 내에 존재하는 효소 활성의 양을 나타냅니다. 정량적 방법을 사용하면 기질 전반에 걸쳐 서로 다른 효소를 비교할 수 있으며 효소 반응에 영향을 미치는 환경 조건(예: 온도, 염도 및 pH)의 변화를 허용할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 단백질 항균제의 효소 활성을 정량적으로 검출하기 위한 염료 방출 분석의 준비 및 성능을 설명합니다.
- 염료 방출 분석 준비
- 동결된 염색된 기질을 실온으로 되돌리고 주어진 효소에 대해 경험적으로 결정된 분석 완충액(인산염 완충 식염수, PBS)으로 두 번 세척합니다.
- 200 μl 반응 부피에 수행할 염료 방출 분석 수를 곱하여 필요한 기질 현탁액의 부피를 계산합니다.
- 분광 광도계를 사용하여 595nm에서 2.0의 광학 밀도(OD)가 달성될 때까지 4.1.2에서 측정된 분석 버퍼의 부피에 염색된 기질을 추가하여 기판 현탁액을 준비합니다. 분광 광도계의 기능 한계 내에서 유지하려면 농축 용액의 1:1 희석에 대해 2.0 OD595를 1.0으로 측정합니다. 분석 버퍼를 공백으로 사용합니다.
메모: 반응에 대한 기질 탁도는 고효율 효소의 활성 수준과 일치하도록 2.0 이상으로 상승할 수 있습니다.
- 분석 완충액에서 평가할 단백질 항균제를 1mg/ml의 예상 농도로 현탁합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 Bicinchoninic acid (BCA) Protein Assay Kit의 마이크로플레이트 분석을 사용하여 분석할 단백질 샘플의 실제 농도를 측정합니다. 분석 버퍼를 사용하여 스톡 현탁액의 농도를 1mg/ml로 조정합니다.
- 단백질 항균제에 대한 최적의 배양 조건을 결정하기 위한 염료 방출 분석 사용
- 스톡 단백질 항균 현탁액을 100ng/μl로 희석합니다. 이 농도는 분석 반응에 추가된 부피당 1μg의 단백질(10μl)의 최종 반응 질량을 제공합니다.
- 박테리아 분해 단백질에 대해 평가할 열 범위를 결정합니다. 이 분석의 열 범위에는 5°C, 15°C, 25°C, 35°C, 45°C, 55°C 및 65°C가 포함되었습니다.
- 0.5ml 마이크로분리관에서 반응 분석을 수행합니다. 각 열 조건에 대해 10μl의 스톡 단백질을 200μl의 준비된 기질 현탁액에 추가합니다.
- 열 순환기에서 8시간 동안 배양하고 시간당 한 번 반전으로 혼합합니다.
- 배양 후 25μl의 에탄올을 첨가하여 반응을 정지시킵니다.
- 3,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 분해되지 않은 불용성 기질을 제거하고, 각 반응 혼합물에 대한 150μl의 반응 상등액을 96웰 평면 바닥 마이크로플레이트로 옮기고, 분해되지 않은 기질의 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다.
- 효소 가수분해 후 기질에서 해리된 가용성 RBB 염료의 양을 측정하여 주어진 기질에 대한 단백질 항균의 효소 활성을 측정합니다. 효소 활성을 정량화하려면 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 595nm에서 상층액의 흡광도를 측정합니다. 표지된 기질에서 상등액으로 방출되는 용해성 염료에 의한 흡광도 증가는 효소 활성의 정량적 측정입니다.
메모: 흡광도의 변화는 활성 단위(AU)로 표시되며, 여기서 1AU는 595nm에서 염료 방출 반응 상등액의 광학 밀도를 0.01 증가시킵니다. 효소를 제외한 모든 반응 성분과 함께 배양된 blank 반응은 배양으로 인해 RBB 표지 기질에서 방출되는 염료를 빼는 데 사용됩니다. 최적의 효소 온도는 피크 활성 단위 측정을 제공합니다.