박테리아 균주에서 산화 스트레스 반응을 평가하기 위한 Spot Plate Assay

초록

출처: Ketelboeter, L. M. et al., 박테리아 피오멜라닌 생성을 억제하고 산화 스트레스에 대한 민감도의 해당 증가를 결정하는 방법. J. Vis. 특급 (2015)

이 동영상은 박테리아 균주의 산화 스트레스 반응을 평가하기 위해 맞춤화된 스폿 플레이트 분석을 보여줍니다. 일부 균주는 항산화 색소인 피오멜라닌(pyomelanin)을 생성합니다. 반대로, 시험제로 처리되어 피오멜라닌 생산이 감소한 균주는 산화 스트레스에 대한 민감성이 증가하여 피오멜라닌 생성 균주에 비해 세포 생존력이 감소합니다.

프로토콜

1. 배양 배지, 항생제 및 2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)의 제조

1. Luria-Bertani (LB) 육수(트립톤 1%, 효모 추출물 0.5%, 염화나트륨 0.25%, H₂O의 NaCl)를 만들고 적절한 부피로 분취합니다. 오토클레이브로 살균하십시오. 실온에서 보관하십시오.
2. 250ml 플라스크에 100ml LB 한천(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.25% NaCl, 1.5% H_2O내 한천)을 만듭니다. 오토클레이브로 살균하고 실온에서 보관하십시오. 플레이트에 붓기 전에 한천이 녹았는지 확인하십시오.
   메모: LB 한천 100ml가 들어 있는 플라스크는 4개의 플레이트를 생성합니다. LB 한천의 양은 분석에 필요한 플레이트의 수에 따라 변경할 수 있습니다.
3. 인산염 완충 식염수, PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM 염화칼륨, KCl, 10 mM 인산이나트륨, Na₂HPO₄, 2 mM 인산이수소 칼륨, KH₂PO₄)를 만듭니다. 오토클레이브 또는 여과로 살균하고 실온에서 보관하십시오.
4. 겐타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin) 및 토브라마이신(tobramycin)에 대한 항생제 저장 용액을 준비합니다.
   1. 100mg/ml 겐타마이신, 30mg/ml 카나마이신 및 10mg/ml 토브라마이신을 포함하는 녹농균 균주에 대한 적절한 항생제 스톡 농도를 준비합니다. 항생제를 물에 녹이고 여과 살균 (0.2 μm)하고 4 ° C에서 보관하십시오. 연구 된 박테리아에 따라 항생제와 농도를 변경하십시오.

2. 산화 스트레스 반응을 위한 스폿 플레이트 분석

1. 테스트할 균주의 야간 배양을 설정합니다. 16 x 150 mm 시험관(균주당 1개)에 2ml LB 육수를 넣고 각 균주에서 분리된 1개의 콜로니를 접종합니다. 37°C에서 공기 배양기의 조직 배양 회전기에서 폭기로 하룻밤 동안 배양합니다.
2. 하룻밤 배양의 OD₆₀₀을 측정합니다. 배지에 존재하는 피오멜라닌을 제거하기 위해 OD₆₀₀ 판독값을 측정하기 전에 배양물을 세척하십시오.
3. 마이크로 원심분리기에서 1ml의 배양액을 16,000 x g으로 2분 동안 원심분리하여 배양액을 세척합니다. 마이크로 피펫터로 상층액과 느슨하게 펠릿화된 세포를 제거하고 고체 세포 펠릿을 1ml LB에 재현탁합니다.
4. 다음날, 산화 스트레스 인자로 H₂O_{2 를} 함유 한 LB 한천 플레이트를 준비합니다. 0에서 1mM까지의 H₂O₂ 농도 범위가 좋은 시작점입니다.
   1. LB 한천 플라스크를 녹입니다. 실온에서 매체를 약 50°C로 냉각합니다.
   2. H₂O_{2 를} 원하는 농도로 냉각 된 매체에 직접 첨가합니다. 플라스크를 소용돌이치며 섞습니다. _H2O2의 농도와 농축된_H2O2의 부피에 대해서는 표 1을 참조하여 첨가한다. 이 값은 LB 한천 100ml를 기준으로 합니다.
   3. H₂O_{2 를} 첨가 한 직후 플레이트를 붓고 표면을 화염으로 만들어 기포를 제거합니다. 수율은 LB 한천 100ml당 4개의 플레이트입니다. 플레이트에 H₂O₂ 농도를 표시합니다.
   4. 플레이트에서 과도한 수분을 제거하기 위해 팬을 30분 동안 작동시킨 상태에서 생물학적 흐름 후드에 덮개를 덮지 않은 플레이트를 놓습니다.
      메모: 접시는 준비된 당일에 사용하십시오. 이렇게 하지 않으면 data.
      일관되지 않은 데이터가 생성될 수 있습니다. 메모: 파라콰트와 같은 산화 스트레스 요인은 이 분석에서 H₂O₂ 를 대체할 수 있습니다. 다른 산화 스트레스 요인에 사용되는 농도는 H₂O_{2 에} 사용되는 농도와 다를 수 있습니다.
5. 하룻밤 배양의 OD₆₀₀을 세척하고 측정합니다.
6. 모든 야간 배양의 OD₆₀₀을 테스트 중인 균주 세트에 대한 가장 낮은 값으로 정규화합니다. 녹농균은 일반적으로 LB에서 하룻밤 동안 자랄 때 약 2.5의 OD₆₀₀을 갖습니다.
   1. 배양액을 총 1ml의 부피에서 가장 낮은 OD₆₀₀으로 희석하는 데 필요한 배양량을 결정합니다. 예를 들어, 배양물의 OD₆₀₀이 3이고 균주 집합에 대한 가장 낮은 OD₆₀₀이 2.5인 경우 (2.5)(1ml) = (3)(x)로 계산을 수행합니다. x = 0.833 ml. 0.833 ml의 배양물을 마이크로 분리 튜브에 넣습니다.
   2. 배양 부피를 1ml로 가져오는 데 필요한 LB + DMSO의 양을 계산합니다. 단계 4.4.1의 예에서 배양액에 첨가된 LB + DMSO의 양은 0.167ml(총 부피 1ml – 배양 0.833ml)입니다. 모든 균주를 희석하는 데 필요한 부피를 기준으로 이러한 희석에 사용할 LB + DMSO의 원액을 만듭니다.
   3. 볼텍싱으로 배양물과 LB + DMSO를 혼합합니다.
7. DMSO의 일정한 농도에서 배양을 유지하려면 PBS + DMSO에서 정규화된 야간 배양물의 10배 연속 희석을 수행합니다.
   1. PBS + DMSO의 원액을 만듭니다. 한 가지 균주에 대한 한 세트의 희석액의 경우 300μM 부피의 DMSO와 PBS를 혼합하여 총 720μl의 부피를 산출합니다. 테스트되는 균주의 수에 따라 이러한 스톡을 확장하거나 축소합니다.
   2. ^10-1에서 ^10-7 연속 희석을 위한 마이크로분리 튜브에 라벨을 부착합니다. 90μl의 PBS + DMSO를 적절한 튜브에 추가합니다. LB + DMSO에서 성장한 균주에는 PBS + DMSO를 사용합니다.
   3. 적절한 ^10-1 희석 튜브에 10μl의 배양액을 추가합니다. 와류로 혼합하고 ^10-1 희석 10 μl를 ^10-2 희석 튜브로 옮깁니다. 모든 희석이 수행될 때까지 반복합니다. 희석 사이에 피펫 팁을 교체하십시오.
8. LB + H₂O₂ 플레이트에 ^10-3 - ^10-7 희석 중 5 μl를 각 균주에 대해 중복하여 발견합니다. 가장 희석된 것부터 가장 덜 희석된 것까지 얼룩이 도금된 경우(^10-7에서 ^10-3) 하나의 피펫 팁을 사용합니다. 액체가 접시에 마를 때까지 접시를 기울이거나 기울이지 마십시오.
9. 변형률에 따라 37 ° C (공기 인큐베이터)에서 24-48 시간 동안 플레이트를 배양하십시오 .
   참고: 녹농균 PAO1은 배양 24시간 후 LB에 적당한 크기의 집락을 갖게 됩니다. PAO1과 거의 같은 크기의 콜로니가 생길 때까지 균주를 배양합니다.
10. 트랜스루미네이터 위의 CCD 카메라를 사용하여 플레이트를 촬영합니다. 필요한 경우 대비를 위해 사진을 편집하고 같은 크기로 자릅니다. 산화 스트레스에 대한 민감도의 변화를 결정하기 위해 각 지점의 군집 수를 세십시오.

표 1 : 산화 스트레스 스폿 플레이트 분석을 위해 LB 한천에 첨가하기 위해 H₂O_{2 의} 농도.이 표는 다양한 H₂O₂ 농도와 100 ml LB 한천에 첨가 할 농축 H₂O₂ 2 스톡의 해당 양을 제공합니다.

년 월 년 년 개 일

H2O2 (mM)의 최종 농도	9.79 M H2O2 (30 % wt)의 양 (μl)
0	0
0.2	2.04
0.4	4.09
0.6	6.13
0.8	8.17
1	10월 21

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)	시그마-알드리치	SML0269-50mg	니티시논이라고도 합니다. DMSO에 용해됩니다.
H2O2	시그마-알드리치	216763-100ML	H2O에서 30 중량 %. 안정.