국물 내 마이코박테리아에 대한 테스트 컴파운드의 효과 평가

Abstract

출처: Zheng, X., et al. 세포 내 결핵균을 표적으로 하는 억제제의 효능 및 세포 독성 스크리닝을 위한 시스템. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis에 대한 항생제 효능을 결정하기 위한 육체 내 분석을 보여줍니다. 박테리아 배양액은 다양한 농도의 살균 항생제로 배양됩니다. 살균 효능은 레사주린(resazurin) 분석을 사용하여 생존 가능한 박테리아의 존재를 평가하여 측정됩니다.

Protocol

1. 박테리아 균주 및 성장 매체

1. 탈이온수 460mL에 소 혈청 알부민 25g, 포도당 10.0g, 염화나트륨 4.05g을 가용화하여 알부민 포도당과 염스톡 용액(ADS)을 만듭니다. ADS를 필터 멸균하고 4°C에서 보관합니다.
2. 정제수 900mL에 7H9 분말 4.7g과 글리세롤 2mL를 넣어 7H9 육수를 만듭니다. 7H9 육수를 121°C에서 10분 동안 오토클레이브하고 계속하기 전에 실온으로 식힙니다. 7H9 육수 900mL에 ADS 100mL와 Tween80 0.5mL를 첨가하여 7H9ADST를 만듭니다. 4 °C에서 보관하십시오.
3. kanamycin 황산염의 50 mg의 무게를 달고 탈이온수 1 mL에 용해시키십시오; 마지막 농도는 50 mg/mL입니다. 필터 멸균 및 -20 °C에서 보관하십시오. 7H9ADST.
   1L당 0.5mL의 카나마이신 원액을 추가합니다. 메모: 이 배지는 새로 만들어야 하므로 배양 크기에 따라 볼륨의 크기를 적절하게 조정합니다.
4. 7H9ADST에서 M. 결핵을 성장시키고 서 있는 배양에서 카나마이신을 보충합니다. 매일 배양액을 흔들어 OD₆₀₀이 1.0에 도달하기 전에 희석하여 응집되지 않도록 하십시오.
   메모: 이 방법의 개발에 사용된 M. tuberculosis 균주는 pJAK2.A 플라스미드로 H37Rv 형질전환되었습니다. pJAK2.A는 pMV361 벡터를 기반으로 하는 통합 플라스미드로, hsp60 promoter에서 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 고수준으로 발현할 수 있으며 kanamycin을 사용하여 선택할 수 있습니다.

2. 레사주린 분석을 이용한 배양 내 활성 분석

1. M. tuberculosis는 7H9ADST에서 중간 로그 단계(~ 0.5 - 0.8 OD600)까지 성장합니다. 7H9ADST로 배양물을 0.01 OD₆₀₀으로 희석합니다. 7H9ADST에서 화합물을 테스트 농도의 2배로 희석하고 각 희석된 화합물 100μL를 각 웰에 분취합니다.
2. 희석된 박테리아 현탁액 100μL를 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5일 동안 배양합니다. 레사주린 10mg을 탈이온수 100mL와 멸균 필터에 녹입니다.
3. 30μL의 레사주린 용액을 추가하고 48시간 후 색상 변화를 모니터링합니다. 박테리아 성장은 파란색에서 분홍색으로의 색상 변환으로 표시됩니다.
   메모: 정량 분석은 530 - 560 nm에서 여기와 함께 590 nm에서 형광을 측정하거나 570 nm 및 600 nm에서 흡광도를 측정하여 수행할 수도 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
미들브룩 7H9	Becton, 디킨슨 앤 컴퍼니	271210
트윈80	피셔 사이언티픽	T164
알부민, 소 pH7	어피메트릭스	10857
포도당	피셔 사이언티픽	BP350
소금	피셔 사이언티픽	BP358
카나마이신 설페이트	피셔 사이언티픽	BP906
레사주린	알파 에자르	B21187
글리세롤	피셔 사이언티픽	BP229
M. 결핵 H37Rv
96웰 플랫 바닥 화이트 플레이트	코 닝	3917
95웰 플랫 바닥 클리어 플레이트	코 닝	3595
투명 플레이트 실러	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	AB-0580
광도계	어플라이드 바이오시스템즈	트로픽스 TR717