PBMC와 공동 배양된 X선이 조사된 상피 세포에서 TEER 측정

초록

출처: Babini, G., et al. X선이 조사된 Caco-2 세포와 PBMC 사이의 누화를 조사하기 위한 공동 배양 방법입니다. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 PBMC 세포의 존재 유무에 관계없이 조사된 Caco-2 세포의 상피 횡단 전기 저항을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법을 통해 상피 세포 장벽에 대한 방사선 및 면역 세포의 시너지 효과를 연구할 수 있습니다.

프로토콜

1. 조사 설정

참고: Caco-2 세포에 대한 방사선 조사는 다양한 유형의 암을 치료하는 데 일상적으로 사용되는 선형 가속기를 사용하여 Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico(IRCCS) S. Maugeri(이탈리아 파비아)의 방사선 치료 부서에서 수행되었습니다.

1. 광자 X선 에너지를 6MV 피크로 설정합니다. 선형 가속기는 펄스 영역(두 개의 연속 펄스 사이의 시간 약 4ms, 최대 1 × ^10-3 Gy/p의 선량 속도로 단일 펄스 지속 시간 약 5μs)에서 작동합니다.
2. Caco-2가 포함된 인서트가 포함된 6웰 플레이트를 방사선 소스에서 100cm 떨어진 1.4cm 두께의 플렉시글라스 시트(사용된 방사선 축적물보다 약간 더 큰 거리에 해당)의 X선 궤적에 놓습니다.
3. 방사선 조사가 발생하기 전에 각 샘플에 0.5cm 두께의 볼루스를 놓아 후방 산란 방사선 성분과 하전 입자의 평형을 보장합니다.
4. 세포(2 - 10 Gy 범위의 선량)에 평평하고 대칭적(± 2%), 20 x 20cm₂ 방사선 필드 및 3 Gy/min.
   의 선량률로 조사합니다. 메모: 대조군 "가짜"방사선 조사 된 세포는 방사선 조사실에 들어가지 않고 조사 된 세포와 동일한 절차 조건을 거쳤습니다 (수신 선량 : 0 Gy).
   주의: 이온화 방사선 생성 장치는 전문 인력만 사용해야 합니다.

2. 상피 횡단 전기 저항(TEER)

1. 6-well plate 공동 배양 삽입물(폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 2 x 10⁶ pores/cm2)에 방사선 조사 1주일 전에 5 ×^{5 Caco-2} 세포를 시드합니다.
2. 조사 1시간 전에 전압계/저항계로 TEER을 측정합니다.
3. 1.1 - 1.4 단계에서 설명한 대로 세포를 조사합니다.
4. 5% CO₂를 함유하는 가습 분위기에서 37°C에서 PBMC와 공동 배양의 유무에 따라 Caco-2 세포를 배양합니다.
5. 방사선 조사 후 처음 몇 시간 동안은 매시간 TEER을 측정하고 이후에는 최대 48시간까지 3시간마다 TEER을 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
멀티웰 플레이트용 ThinCert 6웰 세포 배양 인서트	그라이너 바이오 원	657610	설비
세포 배양 멀티웰 플레이트, 6웰	그라이너 바이오 원	657160	플라스틱
세포 배양 멀티웰 플레이트, 24웰	그라이너 바이오 원	662160	플라스틱
L-글루타민이 없는 RPMI 1640	론자	12-167층	시약
밀리셀-ERS 전압계/저항계	밀리포어	메르스 00001	설비