항균제 스크리닝을 위한 Peg Plate Biofilm Assay

초록

출처: Dalecki, A. G., et al. 레사주린 기반 약물 감수성 분석을 사용하여 황색포도상구균 생물막 관련 포도상구균 표적화. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 페그 플레이트를 사용하여 생물막을 효율적으로 제거하는 항균 화합물을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 이 방법론은 항균 화합물로 처리한 후 생물막의 대사 상태를 모니터링하여 최소 생물막 박멸 농도를 쉽게 측정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 생물막 개시

1. 영양이 풍부한 배지에서 생물막을 생산하는 유기체의 배양을 성장시킵니다. 글리세롤 스톡에서 추출한 10ml의 Mueller-Hinton 배지에 포도상구균 균주 Newman을 접종합니다. S. aureus를 장갑을 끼고 생물 안전 캐비닛 내에서 취급하는 것과 관련된 모든 작업을 수행하십시오.
2. 37 °C에서 16 시간 동안 회전식 쉐이커(100-200 rpm)에서 배양합니다.
3. 분광 광도계와 표준 큐벳(경로 길이: 1cm)을 사용하여 배양물의 OD₆₀₀을 측정합니다.
4. 다음 공식을 사용하여 chelexed Roswell Park Memorial Institute 배지(CRPMI)에서 0.1의 OD_{600(접종물)}이 포함된 접종물 20ml를 준비하는 데 필요한 배양의 부피(V)를 계산합니다.
   1. 계산된 배양 부피(위에서)를 원심분리 튜브와 펠릿 세포에 10,000 x g에서 1분 동안 회전시켜 추가합니다. 생물막 접종물을 준비하려면 사용한 성장 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 20ml CRPMI에 재현탁합니다.
5. 25ml 용기에 접종물을 붓습니다.
6. 멸균 96웰 페그 플레이트의 뚜껑을 똑바로 위로 당겨 조심스럽게 제거합니다.
   참고 : 뚜껑에 매달려 있는 못이 오염되지 않도록 주의해야 합니다. 뚜껑은 생물 안전 캐비닛 내의 깨끗한 표면에 거꾸로 놓을 수 있습니다.
7. 200μl 멀티채널 피펫을 사용하여 바닥 플레이트의 A에서 G까지의 각 웰에 125μl 접종물을 추가합니다.
8. H행의 각 웰에 125μl 멸균 CRPMI 배지를 멸균 대조군으로 채웁니다.
9. 못 뚜껑을 잡고 못이 아래를 향하도록 하여 접시 바닥 위로 잡습니다. 개별 못을 해당 우물에 조심스럽게 정렬합니다. 플레이트와 못 사이의 물리적 접촉을 피하십시오. 정렬되면 뚜껑을 조심스럽게 아래로 내립니다. 페그가 바닥 플레이트에 닿은 후 수행된 재조정은 H 열의 멸균 제어 장치를 오염시킬 수 있으므로 정렬 불량을 피하십시오.
10. 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 접시의 뚜껑을 밀봉하고 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣어 단단히 밀봉합니다. 증발을 최소화하기 위해 백의 공기량을 가능한 한 낮게 유지하십시오.
11. 5 % CO₂ incubator에서 37 ° C에서 48 시간 동안 흔들지 않고 배양하십시오 .
    참고: S. aureus의 경우 48시간의 성장이 최적이지만 사용된 유기체에 따라 다릅니다.
    메모: 정적 배양은 분석을 최적화하기 위한 좋은 시작점이지만, 마이크로플레이트 셰이커에서 150rpm으로 부드럽게 흔드는 것은 일부 S. aureus 분리물의 생물막 형성을 향상시킬 수 있는 변형일 수 있습니다.

2. 생물막 챌린지 플레이트의 준비

1. 생물막 챌린지 당일에 새로운 96웰 플레이트를 가져와서 RT와 평형을 이룬 100μl의 CRPMI를 B열에서 H행의 각 웰에 추가합니다. 일관되지 않은 결과를 피하려면 페그가 내부에 있을 때 200μl의 매체를 수용할 수 있는 96웰 플레이트를 사용하고 생물막 시작 플레이트와 동일한 치수의 웰을 특징으로 합니다.
2. 2.7.
   단계에서 최종 희석을 설명하기 위해 1.0ml의 CRPMI에 최대 4개의 테스트 화합물을 원하는 최종 농도의 2배까지 개별적으로 희석합니다. 참고: 좋은 시작점은 플랑크톤 세포의 억제 농도보다 8배 높은 것입니다.
3. 웰 A1 - A3에 화합물 1 200μl, 웰 A4 - A6에 화합물 2, 웰 A7 - A9에 화합물 3, 웰 A10 - A12에 화합물 4를 추가합니다.
4. 멀티채널 피펫을 사용하여 테스트 화합물을 연속적으로 희석하고 A행에서 B행으로 100μl를 전달하고 혼합합니다.
5. 그런 식으로, 100 μl를 웰로 계속 옮긴다. 각 전송 후 혼합하고 F행에서 멈춥니다.
6. 혼합 후 F 열에서 100μl를 폐기물 용기로 배출합니다. G 행과 H 행으로 액체를 옮기지 마십시오.
7. 멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트의 각 웰에 100μl의 CRPMI를 추가하여 부피를 200μl로 만듭니다. 최종 플레이트 레이아웃은 그림 1을 참조하십시오.

3. 바이오필름 챌린지

1. 200μl의 인산암 완충 식염수(PBS)를 생물막 개시 플레이트와 동일한 치수의 웰을 특징으로 하는 새로운 멸균 96웰 플레이트에 추가합니다.
2. 배양된 생물막 개시 플레이트에서 비닐 봉지와 파라핀 필름을 제거합니다.
3. 뚜껑을 똑바로 들어 올립니다. 페그와 플레이트 바닥 사이의 접촉은 생물막을 손상시킬 수 있으므로 피하십시오. 후속 OD₆₀₀ 분석을 위해 하단 부분을 유지하십시오(3.8 참조).
4. PBS가 들어 있는 플레이트에 못 뚜껑을 올려 플랑크톤 세포를 헹굽니다(3.1단계부터). 못을 5초 동안 담그고 PBS에서 들어 올렸다가 다시 한 번 담그면서 못이 우물 측면에 부딪히지 않도록 주의하십시오.
5. 헹궈낸 페그 뚜껑을 챌린지 플레이트에 넣습니다. 페그와 바닥판 사이의 불필요한 접촉은 생물막을 손상시켜 일관되지 않은 결과를 초래할 수 있으므로 피하십시오.
6. 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 1.10단계에서 설명한 대로 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣습니다.
7. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 흔들지 않고 플레이트를 배양합니다.
8. 3.3에서 생물막 시작 플레이트의 바닥을 가져옵니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰의 박테리아를 재현탁시키고 적절한 마이크로플레이트 리더로 OD₆₀₀을 측정하여 H열의 멸균 대조군을 제외한 모든 웰에서 성장이 발생하는지 확인합니다.

4. 생물막 결정

1. 배양 챔버가 장착되어 있고 레사주린 전환을 검출하기 위해 운동 형광 판독값을 측정할 수 있는 플레이트 리더를 사용하십시오. 530nm 여기 및 590nm 방출을 사용하여 24시간 운동 형광 측정을 설정합니다.
2. 챔버 온도를 37°C로 설정하고 20분마다 플레이트를 판독하도록 합니다. 제조업체의 지침에 따라 플레이트 바닥에서 측정하도록 플레이트 리더를 설정합니다.
3. 멸균 96웰 플레이트에 멀티채널 피펫이 있는 PBS 200μl를 추가하여 세척판을 준비합니다.
4. 20ml의 CRPMI 배지에 400μl의 0.8mg/ml 레사주린 원액을 16μg/ml 레사주린.
   의 최종 농도로 추가하여 바이오필름 회수 배지를 준비합니다. 메모: 레사주린은 피부 자극제로 알려져 있습니다. 취급하는 동안에는 실험복, 스플래시 고글, 장갑을 사용하십시오. CRPMI는 가장 낮은 백그라운드 신호를 제공하기 때문에 생물막 회수 매체로 사용되었지만, 적절한 경우 Mueller Hinton 배지로 대체할 수 있습니다.
5. 멀티채널 피펫을 사용하여 150μl의 생물막 회수 배지를 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
6. 챌린지 플레이트를 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 비닐 봉지와 밀봉 필름을 조심스럽게 제거합니다.
7. 챌린지 플레이트에서 페그 뚜껑을 제거하고 3.4에 설명된 대로 PBS의 플랑크톤 세포를 헹굽니다. 후속 OD₆₀₀ 분석을 위해 챌린지 플레이트의 바닥을 유지하십시오(4.10 참조).
8. 헹군 후 페그 뚜껑을 생물막 회수 매체가 들어 있는 플레이트 바닥에 놓습니다.
9. 플레이트의 측면을 파라핀 필름으로 감싸고 주변 우물의 바닥을 막지 않도록주의하십시오. 플레이트를 포장한 직후 플레이트 리더에 놓고 4.1단계에서 이전에 만든 resazurin kinetic protocol을 시작하여 24시간 동안 kinetic read를 시작합니다.
10. 챌린지 중에 발생하거나 발생하지 않을 수 있는 플랑크톤 세포의 성장을 정량화하려면 마이크로플레이트 리더를 사용하여 전체 챌린지 플레이트 바닥의 OD₆₀₀을 판독합니다. 3.8.
    단계에 제공된 지침을 따릅니다. 참고: 생물막에서 흘러나오는 세포는 웰 바닥에서 덩어리로 자라는 경향이 있으므로 각 웰의 내용물을 조심스럽게 재현탁하십시오. 우물 내의 모든 기포는 OD₆₀₀ 판독을 강력하게 방해하므로 판독 전에 피하거나 제거해야 합니다.

결과

그림 1. 챌린지 플레이트 레이아웃. 챌린지 플레이트의 레이아웃 예시: 6개의 서로 다른 농도에서 4개의 화합물을 3배로 병렬 테스트할 수 있습니다. 처리되지 않은 무균 제어 및 멸균 제어도 포함됩니다. 레이아웃 설계는 멀티채널 피펫을 사용하여 연속 희석액의 편리한 인플레이트 준비를 지원합니다. 농도는 μM 단위입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
뮐러-힌튼 미디엄	옥소이드	CM0405	제조업체의 권장 사항을 따르십시오
RPMI-미디엄	코 닝	17-105-CV
아동권리증명서(CRPMI)	참조 9		RPMI-1640 배지에 Chelex 100 수지를 1시간 동안 주입한 후 10% unchelexed RPMI-1640을 보충
Chelex 100 수지	바이오 라드	142-2822
MBEC 플레이트	(주)이노보텍	19111
레사주린 나트륨 염	시그마	R7017	800 μg/ml DI 정수 필터 멸균
마이크로 플레이트 쉐이킹 플랫폼	하이돌프 티트라맥스 1000
Cytation 3 플레이트 리더	(주)바이오텍
Gen5 소프트웨어	(주)바이오텍		레사주린 전환의 기록 및 분석
네오쿠프로인	시그마	N1501	100% 에탄올에 10mM 스톡을 준비하고 -80ºC에서 보관
황산구리	아크로스 오가닉스	7758-99-8	100mM 원액을 물에 담아 4ºC에서 보관
Cu-네오쿠프로인	자체 제작		네오쿠프로인과 황산구리의 동일한 몰 농도를 혼합하여 생성됩니다. 혼합물을 CRPMI 배지에 원하는 농도로 희석하였다.
겐타마이신	시그마	G3632-1G

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