항균제 스크리닝을 위한 Peg Plate Biofilm Assay

Abstract

출처: Dalecki, A. G., et al. 레사주린 기반 약물 감수성 분석을 사용하여 황색포도상구균 생물막 관련 포도상구균 표적화. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 페그 플레이트를 사용하여 생물막을 효율적으로 제거하는 항균 화합물을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 이 방법론은 항균 화합물로 처리한 후 생물막의 대사 상태를 모니터링하여 최소 생물막 박멸 농도를 쉽게 측정할 수 있습니다.

Protocol

1. 생물막 개시

1. 영양이 풍부한 배지에서 생물막을 생산하는 유기체의 배양을 성장시킵니다. 글리세롤 스톡에서 추출한 10ml의 Mueller-Hinton 배지에 포도상구균 균주 Newman을 접종합니다. S. aureus를 장갑을 끼고 생물 안전 캐비닛 내에서 취급하는 것과 관련된 모든 작업을 수행하십시오.
2. 37 °C에서 16 시간 동안 회전식 쉐이커(100-200 rpm)에서 배양합니다.
3. 분광 광도계와 표준 큐벳(경로 길이: 1cm)을 사용하여 배양물의 OD₆₀₀을 측정합니다.
4. 다음 공식을 사용하여 chelexed Roswell Park Memorial Institute 배지(CRPMI)에서 0.1의 OD_{600(접종물)}이 포함된 접종물 20ml를 준비하는 데 필요한 배양의 부피(V)를 계산합니다.
   1. 계산된 배양 부피(위에서)를 원심분리 튜브와 펠릿 세포에 10,000 x g에서 1분 동안 회전시켜 추가합니다. 생물막 접종물을 준비하려면 사용한 성장 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 20ml CRPMI에 재현탁합니다.
5. 25ml 용기에 접종물을 ....

Results

그림 1. 챌린지 플레이트 레이아웃. 챌린지 플레이트의 레이아웃 예시: 6개의 서로 다른 농도에서 4개의 화합물을 3배로 병렬 테스트할 수 있습니다. 처리되지 않은 무균 제어 및 멸균 제어도 포함됩니다. 레이아웃 설계는 멀티채널 피펫을 사용하여 연속 희석액의 편리한 인플레이트 준비를 지원합니다. 농도는 μM 단위입니다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
뮐러-힌튼 미디엄	옥소이드	CM0405	제조업체의 권장 사항을 따르십시오
RPMI-미디엄	코 닝	17-105-CV
아동권리증명서(CRPMI)	참조 9		RPMI-1640 배지에 Chelex 100 수지를 1시간 동안 주입한 후 10% unchelexed RPMI-1640을 보충
Chelex 100 수지	바이오 라드	142-2822
MBEC 플레이트	(주)이노보텍	19111
레사주린 나트륨 염	시그마	R7017	800 μg/ml DI 정수 필터 멸균
마이크로 플레이트 쉐이킹 플랫폼	하이돌프 티트라맥스 1000
Cytation 3 플레이트 리더	(주)바이오텍
Gen5 소프트웨어	(주)바이오텍		레사주린 전환의 기록 및 분석
네오쿠프로인	시그마	N1501	100% 에탄올에 10mM 스톡을 준비하고 -80ºC에서 보관
황산구리	아크로스 오가닉스	7758-99-8	100mM 원액을 물에 담아 4ºC에서 보관
Cu-네오쿠프로인	자체 제작		네오쿠프로인과 황산구리의 동일한 몰 농도를 혼합하여 생성됩니다. 혼합물을 CRPMI 배지에 원하는 농도로 희석하였다.
겐타마이신	시그마	G3632-1G