원형질막 재밀봉 효율을 측정하기 위한 In vitro Fluorescence-based Assay

초록

출처: Lam, J. G., et al. 포유류 세포에서 원형질막 재밀봉 효율의 고처리량 측정. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 포유류 세포에서 원형질막 재밀봉 효율을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 세포막에 기공을 형성하는 박테리아 독소에 노출됩니다. 세포 외 칼슘 이온이 존재하면 기공은 칼슘 유입을 일으켜 막 재밀봉 사건을 유발합니다. 재밀봉 효율은 DNA 결합 프로피듐 요오드화물 염료를 사용하여 평가되며, 이 염료는 재밀봉된 멤브레인 없이 세포에만 들어갑니다.

프로토콜

1. 준비

1. 셀 도금
   메모: 이 프로토콜에는 히스톤 2B-GFP(H2B-GFP)를 발현하는 인간 자궁경부 상피 세포인 HeLa 및 HeLa가 사용되었지만, 이 분석법은 다른 포유류 세포에 적용할 수 있습니다.
   1. 75cm² 세포 배양 플라스크에서 2mL의 트립신-EDTA 0.25%로 세포를 세척하여 부착 세포를 분리합니다. 사용한 트립신을 2mL의 새 트립신-EDTA 0.25%로 교체하십시오.
   2. 세포가 둥글게 되어 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
   3. 8mL의 성장 배지(10% 열 비활성화 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM)에 세포를 재현탁시킵니다.
   4. 혈구계와 10μL의 세포 현탁액을 사용하여 세포 농도를 측정합니다.
   5. 성장 배지에서 세포를 2.5 x 10⁵ cells/mL의 농도로 희석합니다.
   6. 세포 현탁액을 멸균 피펫 대야에 붓고 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 완전히 혼합합니다.
   7. 12-멀티채널 마이크로피펫과 200 μL 팁을 사용하여 HeLa 세포(2.5 x 10⁴ cells/100 μL/well)를 96-well 평평하고 투명한 바닥의 검은색 폴리스티렌 조직 배양 처리 플레이트에 3회(또는 4중)로 분배합니다.
      메모: 도금 배열은 그림 1에 예로 제시되어 있습니다.
   8. 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C 및 5%_CO2에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
2. 원액 준비
   1. 900mL의 물에 95g의 Hanks Balanced Salt Solution, 0.476g의 MgCl₂(5mM) 및 23.83g의 HEPES(100mM)를 첨가하여 10x Buffer M(M1 및 M2 준비에 사용됨) 1L를 준비합니다. pH를 7.4로 조정하고 부피를 1L로 높입니다. 필터를 살균합니다.
   2. 총 50mL의 물에 11.26g의 D-(+)-포도당을 첨가하여 50x(1.25M) 혈당 50mL를 준비합니다. 필터는 용액을 살균합니다.
   3. 총 50mL의 물에 0.666g의 CaCl₂를 첨가하여 100x(120mM) 칼슘 50mL를 준비합니다. 필터는 용액을 살균합니다.
   4. 물 40mL에 EGTA 0.951g을 첨가하여 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸레테르)-N,N,N',N', 테트라아세트산(EGTA) 10x(50mM) 스톡 50mL를 준비합니다. NaOH를 사용하여 pH를 8로 높여 EGTA를 용해 한 다음 부피를 50mL로 올립니다. 필터는 용액을 살균합니다.
   5. 단일 96웰 플레이트의 경우 50mL의 Medium 1(M1, Ca²⁺ 포함), 50mL의 Medium 2(M2, Ca²⁺-free) 및 EGTA가 보충된 Medium 2 15mL를 준비합니다.
      1. M1의 경우 물 43.5mL에 10x Buffer M 5mL, 100x CaCl₂ 0.5mL 및 50x 포도당 1mL를 추가합니다.
      2. M2의 경우, 물 44mL에 10x Buffer M 5mL와 50x 포도당 1mL를 추가합니다.
      3. M2/EGTA의 경우 12mL의 물에 1.5mL의 10x Buffer M과 1.5mL의 10x EGTA를 추가합니다.
         메모: 프로피듐 요오드화물(PI)을 포함하는 모든 용액은 세포에 첨가하기 직전에 준비해야 합니다.
3. 플레이트 리더/이미징 유세포분석기 설정
   메모: 두 개의 검출 장치(분광형광측정기와 이미징 세포분석기)가 장착된 다중 모드 플레이트 리더를 사용하십시오. 형광단이 광표백되는 것을 방지하기 위해 형광 노출을 제한하십시오.
   1. 분석을 수행하기 전에 플레이트 리더를 37°C로 예열합니다.
   2. 설정 모드 내에서 그에 따라 kinetic assay에 대한 매개변수를 설정합니다.
      1. Monochromator, FL(fluorescence) 및 Kinetic을 광학 구성, 읽기 모드 및 읽기 유형에 대해 각각 선택합니다.
      2. Wavelength Settings(파장 설정)에서 각각 9nm excitation 및 emission bandpass를 선택합니다. 프로피듐 요오드화물(PI)을 사용하는 분석의 경우 여기 및 방출 파장을 각각 535 및 617 nm로 설정합니다.
      3. Plate Type(플레이트 유형)에서 플레이트 형식으로 96 Wells(96 웰)를 선택하고 black-wall clear bottom plate에 해당하는 사전 설정된 플레이트 구성을 선택합니다.
      4. 읽기 영역(Read Area)에서 kinetic 전체에서 분석될 웰을 강조 표시합니다.
      5. PMT and Optics(PMT 및 광학)에서 읽기당 깜박임 수를 6으로 사전 설정하고 Read from Bottom(아래에서 읽기) 상자를 선택합니다.
      6. Timing(타이밍)에서 30분 kinetic assay의 경우 Total Run Time(총 실행 시간) 상자에 00:30:00을 삽입하고 Interval.
         에 대해 00:05:00을 삽입합니다. 참고: 각 시점과 하나의 파장에 대해 전체 96웰 플레이트의 판독 시간은 30초입니다.
      7. 오른쪽의 설정 정보에서 지정된 설정을 확인하고 확인을 선택합니다. Read를 눌러 키네틱 런을 시작합니다.
   3. Settings 모드 내에서 이미징 매개변수를 적절하게 설정합니다.
      1. Optical configuration(광학 구성), read modes(읽기 모드) 및 read type(읽기 유형)에 대해 각각 Minimax(Minimax), Imaging(이미징) 및 Endpoint(엔드포인트)를 선택합니다.
      2. Wavelengths(파장)에서 투과광을 선택하고 456/541nm(GFP) 및 625/713nm(PI)의 여기 및 방출 파장에 해당하는 형광 상자 중 하나 또는 둘 다를 선택합니다.
      3. 1.3.2.3 및 1.3.2.4 단계에서 정의한 대로 Plate Type 및 Read Area에 대해 동일한 옵션을 사용합니다.
      4. Well Area Setting(웰 영역 설정)에서 이미징할 웰 내의 사이트 수를 선택합니다.
         참고: 12개 사이트는 전체 웰 이미지에 해당합니다.
      5. Image Acquisition Settings(이미지 획득 설정)에서 투과광의 노출 시간, 541(GFP) 및 713(PI)을 선택합니다. GFP의 경우 20ms/image의 노출 시간으로 전체 웰을 이미지화합니다. 투과광(TL) 및 PI 형광의 경우 각각 8ms 및 20ms의 노출 시간으로 각 웰 중심의 단일 이미지를 획득합니다.
      6. 오른쪽의 설정 정보에서 지정된 설정을 확인하고 확인을 선택합니다. 96웰 플레이트의 각 웰(12개 이미지/웰)의 전체 표면과 하나의 파장을 이미징하는 데 걸리는 시간은 ~15분입니다. 읽기를 눌러 imaging.
         를 시작합니다. 참고: 96웰 플레이트의 단일 이미지/웰 획득 시간에는 하나의 파장에 대해 플레이트당 ~2.5분이 필요합니다. 위에서 설명한 매개 변수는 우리 실험실의 특정 장비에 해당합니다. 분광 형광 측정: 조정 가능한 9 또는 15nm 대역 통과, > 6 log 동적 범위의 광전자 증배관 검출기, 조정 가능한 15 또는 25nm 방출 대역통과로 1.0nm 증분 여기 파장(250-850nm)을 표시하는 크세논 플래시 램프. 이미징 유세포 분석기: 백색광, 460nm 및 625nm 여기 파장을 사용할 수 있는 조명 광원으로, 20nm 대역 통과, 각각 541nm(108nm 대역 통과) 및 713nm(123nm 대역 통과)를 중심으로 하는 방출 필터, 1.25메가픽셀 12비트 전하 결합 장치 카메라에 연결된 4X 대물렌즈
      .

2. 분석

참고: 분석 시 세포는 70-90% 융합되어야 합니다. 세척 단계 중에 배지를 우물의 측벽(세포 바로 위가 아님)에서 제거하여 적용해야 합니다. 3.1.5단계까지 응집을 방지하기 위해 LLO의 온도를 < 4°C로 유지합니다.

1. 37°C에서 예열된 M1에 30μM PI의 스톡과 37°C에서 예열된 M2에 30μM PI의 스톡을 준비합니다.
2. 다음과 같이 12-멀티채널 마이크로피펫과 200μL 팁을 사용하여 플레이트 1의 세포를 부드럽게 세척합니다.
   1. 수리가 허용되는 조건의 경우, 성장 배지를 제거하고 37°C에서 예열된 200μL/웰 M1으로 세포를 두 번 세척합니다. 배지를 30μM PI를 포함하는 100μL/웰의 따뜻한 M1로 교체합니다.
   2. 복구 제한 조건의 경우, 성장 배지를 제거하고 5mM EGTA를 함유한 200μL/웰 웜 M2로 세포를 한 번 세척하여 Ca²⁺를 킬레이트화한 다음 200μL/웰 M2로 1회 세척합니다. 배지를 30μM PI를 포함하는 100μL/잘 따뜻한 M2로 교체합니다.
   3. 성장 배지를 세척하고 프로피듐 요오드화물을 함유하는 배지로 교체한 후 2.1.3단계로 직접 이동합니다.
3. 투과광, GFP 및 PI 아래의 이미지 플레이트 1.3.3(pre-kinetic)에 자세히 설명되어 있습니다. 이 단계는 15-20분 정도 걸립니다.
4. 2.1.3단계의 15분 동안 다음과 같이 12-멀티채널 마이크로피펫과 200μL 팁을 사용하여 플레이트 2를 준비합니다.
   1. 얼음 위에 96웰의 둥근 바닥 폴리프로필렌 마이크로플레이트를 놓습니다. 플레이트 1에 해당하는 실험 설계를 사용하여 플레이트를 구성합니다(그림 1).
   2. 수리가 허용되는 조건의 경우, 60μM PI를 포함하는 100μL/웰의 얼음처럼 차가운 M1을 추가한 다음, 대조군에 대해 4x LLO를 포함하거나 포함하지 않는 얼음처럼 차가운 M1의 100μL/웰을 추가합니다.
   3. 수리 제한 조건의 경우 60μM PI를 포함하는 100μL/웰의 얼음처럼 차가운 M2를 추가한 다음 대조군에 대해 4x LLO를 포함하거나 포함하지 않는 100μL/웰의 얼음처럼 차가운 M2를 추가합니다.
5. 이미징 플레이트 1(단계 2.1.3) 후 즉시 알루미늄 호일을 사용하여 플레이트가 얼음과 직접 접촉하지 않도록 분리하여 얼음 위에 놓습니다. 플레이트 1을 5분 동안 식히십시오.
6. 12채널 마이크로피펫과 200μL 팁을 사용하여 각 웰에서 플레이트 2로 100μL를 이동하여(단계 2.1.4) 플레이트 1의 해당 웰로 이동합니다. 플레이트 1의 매체에 독소를 적절하게 분배하려면 반월판 아래에 팁을 삽입하고 기포가 발생하지 않도록 볼륨을 부드럽게 배출합니다.
   참고: 위아래로 피펫팅하면 실수로 세포가 분리될 수 있으므로 피펫팅을 하지 마십시오.
7. 독소가 세포에 결합할 수 있도록 플레이트를 1분 더 방치하고 분광형광측정기 모드를 사용하여 운동 분석을 위해 플레이트 1을 플레이트 리더로 즉시 옮깁니다(1.3.2단계).
8. kinetic assay가 끝나면 즉시 1.3.3단계를 사용하여 image plate 1(post-kinetic)을 수행합니다.

3. 분석: 셀 열거

1. microplate cell enumeration 소프트웨어를 사용하여 핵 형광을 기반으로 세포 수를 측정합니다.
   1. Settings(설정) 내에서 Re-analysis(재분석)를 선택하고 Image Analysis Settings(이미지 분석 설정) 내의 범주 섹션에서 541을 객체 찾기 위한 파장으로 사용하는 Discreet Object Analysis(신중한 객체 분석)를 선택합니다.
   2. Find Objects(개체 찾기) 옵션에서 Draw on Images(이미지에 그리기) 찾기 방법을 사용하여 설정 탭에서 Nuclei를 선택하고 Apply(적용)를 누릅니다.
   3. OK 및 Read를 눌러 셀 계수 알고리즘을 시작합니다.

결과

그림 1: 실험 설계. 흐름도는 처리되지 않은 세포를 대조하는 것과 비교하여 7가지 테스트 조건의 효과를 테스트하도록 구성된 대표적인 플레이트 설계를 보여줍니다. 적절한 경우 마약 차량과 같은 추가 통제가 포함되어야 합니다. 세포는 실험 24시간 전에 도금(플레이트 1)됩니다. 실험 당일, 플레이트 1의 세포를 37°C에서 예열된 M1 또는 M2 배지로 세척하고 플레이트를 사전 키네틱(pre-kinetic)으로 이미지화(TL, GFP 및 PI 형광)합니다. 15분의 이미징 동안 시약이 얼음 위에 플레이트 2에 추가됩니다. 이미징 후 플레이트 1을 즉시 얼음 위에 5분 동안 놓고 100μL/웰을 플레이트 2에서 플레이트 1로 옮깁니다. 플레이트 1을 플레이트 리더에 배치하여 37°C에서 30분 동안 kinetic assa...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SpectraMax i3x 멀티모드 마이크로플레이트 리더	분자 장치	i3엑스
MiniMax 300 이미징 유세포분석기	분자 장치	5024062
TO-프로-3	써모피셔 사이언티픽	T3605
프로피듐 요오드화물	써모피셔 사이언티픽	P3566
헬러	증권 시세	CCL2
헤라 H2B-GFP	밀리포어	SCC117
트립신-EDTA 0.25%	써모피셔 사이언티픽	25200056
96웰 코닝 플랫 바텀 블랙 폴리스티렌 조직 배양 처리 플레이트	코 닝	3603
행크스의 균형 잡힌 소금	시그마-알드리치	H4891
에그타	ISC 바이오익스프레스	0732-100지
헤페스	피셔 사이언티픽	BP310-500
D-(+)-포도당, HybriMax	시그마-알드리치	G5146-1KG

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