원형질막 재밀봉 효율을 측정하기 위한 In vitro Fluorescence-based Assay

초록

출처: Lam, J. G., et al. 포유류 세포에서 원형질막 재밀봉 효율의 고처리량 측정. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 포유류 세포에서 원형질막 재밀봉 효율을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 세포막에 기공을 형성하는 박테리아 독소에 노출됩니다. 세포 외 칼슘 이온이 존재하면 기공은 칼슘 유입을 일으켜 막 재밀봉 사건을 유발합니다. 재밀봉 효율은 DNA 결합 프로피듐 요오드화물 염료를 사용하여 평가되며, 이 염료는 재밀봉된 멤브레인 없이 세포에만 들어갑니다.

프로토콜

1. 준비

1. 셀 도금
   메모: 이 프로토콜에는 히스톤 2B-GFP(H2B-GFP)를 발현하는 인간 자궁경부 상피 세포인 HeLa 및 HeLa가 사용되었지만, 이 분석법은 다른 포유류 세포에 적용할 수 있습니다.
   1. 75cm² 세포 배양 플라스크에서 2mL의 트립신-EDTA 0.25%로 세포를 세척하여 부착 세포를 분리합니다. 사용한 트립신을 2mL의 새 트립신-EDTA 0.25%로 교체하십시오.
   2. 세포가 둥글게 되어 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
   3. 8mL의 성장 배지(10% 열 비활성화 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM)에 세포를 재현탁시킵니다.
   4. 혈구계와 10μL의 세포 현탁액을 사용하여 세포 농도를 측정합니다.
   5. 성장 배지에서 세포를 2.5 x 10⁵ cells/mL의 농도로 희석합니다.
   6. 세포 현탁액을 멸균 피펫 대야에 붓고 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 완전히 혼합합니다.
   7. 12-멀티채널 마이크로피펫과 200 μL 팁을 ....

결과

그림 1: 실험 설계. 흐름도는 처리되지 않은 세포를 대조하는 것과 비교하여 7가지 테스트 조건의 효과를 테스트하도록 구성된 대표적인 플레이트 설계를 보여줍니다. 적절한 경우 마약 차량과 같은 추가 통제가 포함되어야 합니다. 세포는 실험 24시간 전에 도금(플레이트 1)됩니다. 실험 당일, 플레이트 1의 세포를 37°C에서 예열된 M1 또는 M2 배지로 세척하고 플레이트를 사전 키네틱(pre-kinetic)으로 이미지화(TL, GFP 및 PI 형광)합니다. 15분의 이미징 동안 시약이 얼음 위에 플레이트 2에 추가됩니다. 이미징 후 플레이트 1을 즉시 얼음 위에 5분 동안 놓고 100μL/웰을 플레이트 2에서 플레이트 1로 옮깁니다. 플레이트 1을 플레이트 리더에 배치하여 37°C에서 30분 동안 kinetic assa.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SpectraMax i3x 멀티모드 마이크로플레이트 리더	분자 장치	i3엑스
MiniMax 300 이미징 유세포분석기	분자 장치	5024062
TO-프로-3	써모피셔 사이언티픽	T3605
프로피듐 요오드화물	써모피셔 사이언티픽	P3566
헬러	증권 시세	CCL2
헤라 H2B-GFP	밀리포어	SCC117
트립신-EDTA 0.25%	써모피셔 사이언티픽	25200056
96웰 코닝 플랫 바텀 블랙 폴리스티렌 조직 배양 처리 플레이트	코 닝	3603
행크스의 균형 잡힌 소금	시그마-알드리치	H4891
에그타	ISC 바이오익스프레스	0732-100지
헤페스	피셔 사이언티픽	BP310-500
D-(+)-포도당, HybriMax	시그마-알드리치	G5146-1KG

(영문) 표시기 시리즈 년