광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색

초록

출처: Niezgoda, M. et al., 포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 검사. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 감염된 쥐의 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색을 보여줍니다. 이 과정에는 탈파라핀화(deparaffinization) 및 알코올 처리(alcohol treatment)가 포함되며, 항원 접근성을 높이기 위한 단백질 분해 처리(proteolytic treatment)가 이어집니다. 면역조직화학 염색을 통해 붉은 침전물이 나타나 조직 단면에 광견병 항원이 존재함을 확인합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 조직의 포르말린 고정

1. 부검 후 채취한 3-5mm의 뇌 조직을 10% 인산염 완충 포르말린 용액(1:20 - 1:50 조직/포르말린 비율)에 24-72 h.
   동안 놓습니다. 주의: 포르말린은 독성이 있는 정착제입니다.
2. 포르말린의 대략적인 조직 무게(크기), 조직 유형(뇌 영역) 및 부피를 기록합니다. 실험실에서 고정 시간에 대한 기록을 문서화하고 유지하는 것이 중요합니다.
3. 포르말린 고정 후 및 처리 전에 조직을 더 오래 보관하려면 조직을 70% 에탄올에 넣으십시오.

2. 조직 처리

1. 표본 고정 후, 중요한 뇌 영역, 예를 들어 뇌간, 소뇌(3엽) 또는 해마(양쪽 해마)의 단면을 포함하도록 조직을 해부하고 각각 3-5mm 두께로 절단하여 처리 카세트에 넣습니다.
2. 파라핀 왁스 침투를 위해 조직 카세트를 처리하고, 파라핀 블록에 삽입하고, 마이크로톰에서 절편화(3 - 6 μm)합니다.

3. 재료 준비 / 염색 접시

1. 그림 1과 같이 염색 접시(Table of Materials)를 설정합니다. 각 접시에 용액 250mL를 채웁니다.
2. 3-Amino-9-ethylcarbizole (AEC) 기질 스톡 용액의 준비
   1. 유리 피펫을 사용하여 3-아미노 9-에틸카르바졸(AEC) 20mg 정제 1정을 5mL의 N,N, 디메틸포름아미드에 용해시킵니다.
      주의: AEC는 발암 물질입니다.
3. 항원 회수를 위한 프로테아제(예: 프로나제) 원액의 제조
   1. 프로테아제 7mg을 인산염 완충 식염수(PBS) 200mL에 용해시킵니다.
4. 헹굼 버퍼 PBS-T의 준비
   1. 10mL의 트윈 80 - 990mL의 PBS를 추가합니다. 균질한 용액을 형성하기 위해 잘 혼합하십시오.

4. 탈파라핀화와 조직 재수화

1. 마이크로톰을 사용하여 5μm 파라핀 단면을 만들고 38°C의 수조에 띄운 다음 유리 슬라이드에 모읍니다. 시약 저항성 펜/마커로 슬라이드에 레이블을 지정합니다.
2. 슬라이드를 트레이에 놓고 55-60°C 오븐에서 1시간 동안 녹입니다. 바이러스 항원을 파괴할 수 있으므로 온도를 60°C 이상으로 올리지 마십시오.
3. 오븐에서 슬라이드를 제거하고 접시 1, 2, 3에서 각각 5분씩 3회 연속 자일렌 헹굼으로 즉시 파라핀을 제거합니다.
에
4. 탄올을 탈이온수로 희석하는 것을 줄이기 위해 순차적으로 침지하여 슬라이드의 섹션을 재수화합니다 : (4-11은 딥 린스입니다) 접시 4 : 크실렌 / 100 % 에탄올 (1 : 1); 접시 5 : 100 % 에탄올; 접시 6 : 100 % 에탄올; 접시 7 : 95 % 에탄올; 접시 8 : 95 % 에탄올; 접시 9 : 80 % 에탄올; 접시 10 : 70 % 에탄올; 접시 11 : 탈이온수(그림 1. 접시 세팅).
   주의: 크실렌은 유해 화학 물질이므로 작업은 흄 후드에서 수행해야 합니다.

5. 단백질 분해 항원 회수

1. 접시 12에서 단백질 분해 항원 회수를 위해 30분 동안 프로테아제(PBS 2.5μg/mL)로 슬라이드를 처리합니다.
2. 그런 다음 PBS-T에서 10분 동안 헹굽니다(접시 13).
3. 3% 과산화수소로 10분 동안 처리합니다(요리 14).
4. 다시 PBS-T로 10분 동안 씻습니다(접시 15).

6. 염색 절차

1. 나머지 슬라이드를 버퍼에 담근 상태로 한 번에 하나씩 슬라이드를 처리합니다(전체 슬라이드 홀더를 제거하지 마십시오. 슬라이드를 젖은 상태로 유지하십시오). 하나의 슬라이드를 제거하고 조직 섹션 주변에서 여분의 버퍼(종이 타월 사용)를 닦아내고 조직 섹션을 방해하지 않도록 주의합니다. 물에 적신 종이 타월을 올려 만든 습도 챔버에서 일반 염소 세럼(차단)을 사용하여 실온의 실험실 벤치 상단에 15분 동안 슬라이드를 배양합니다.
2. 미리 결정된 최적의 희석 1차 광견병 항체(1:250 희석, 미발표)(양성 대조군) 및 음성 대조 항체를 위와 동일한 실온에서 60분 동안 배양합니다(단계 6.1.) 중간에 세척하지 않고 합니다.
3. 60분 후 PBS-T로 10분 동안 씻습니다(접시 16).
4. 비오틴화된 항체(종 특이적)를 실온의 습도 챔버에서 15분 동안 배양합니다(6.1단계와 동일하게 취급).
5. PBS-T로 10분 동안 세척합니다(요리 16).
6. Streptavidin- 양 고추 냉이 과산화 효소 (HRP) 복합체를 실온의 습도 챔버에서 15 분 동안 배양합니다 (6.1과 동일하게 취급
).
7. PBS-T로 10분 동안 세척합니다(요리 16).
8. 과산화효소 기질, 아미노-에틸카르바졸(AEC)을 실온의 습도 챔버에서 10분 동안 배양합니다. 사용 직전에 AEC를 만듭니다. 이렇게 하려면 14mL의 0.1M 아세테이트 완충액, pH 5.2에 AEC 원액 1mL를 추가합니다. 0.15mL의 3% 과산화물, H₂O₂를 추가합니다. 사용 직전에 혼합물을 여과합니다 (0.45 μm 필터) .
   메모: AEC의 작업 솔루션은 2-3시간 동안만 안정적입니다. AEC 스톡 솔루션은 냉장고에 장기간 보관할 수 있습니다.
9. 탈이온수로 10분 동안 세척(접시 17)
10. Gill's Hematoxylin으로 2분 동안 탈이온수로 1:2 희석합니다(접시 18).
11. 탈이온수 딥 린스(접시 19 및 20)로 과도한 Hematoxylin을 헹굽니다.
12. Scott의 수돗물로 30초 동안 헹굽니다(블루잉 솔루션) 접시 21.
13. 탈이온수로 10분 세척(접시 22)
14. 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거하고 수용성 장착 매체로 장착합니다.
15. 광학 현미경에서 슬라이드를 읽습니다.

결과

그림 1: IHC 테스트를 위한 다양한 단계를 나타내는 순서도. 

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3% 과산화수소	Pharamacy 브랜드		기성품 3% H2O2
3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC)	밀리포어 시그마	A6926
아세테이트 완충액 pH 5.2	폴리 사이언티픽 R&D Corp.	S140
완충된 포르말린 10% 인산염 완충	피셔 사이언티픽	재질 보기 SF100-4	인증
커버 슬립 코닝	피셔 사이언티픽	제12-553-471	24 X 50 밀리미터
에탄올 190 프루프	팜코-AAPER	111000190
에탄올 200 프루프	팜코-AAPER	111000200
Gill의 헤마톡실린 제형 #2	피셔 사이언티픽	CS401-1D
HistoMark 비오틴-스트렙타비딘 과산화효소 키트	세라케어	71-00-18	마우스 1차 항체
면역히스토마운트	밀리포어 시그마	나1161	마운팅 미디어
N, N, 디메틸 포름 아미드 GR	피셔 사이언티픽	D119 (영어
인산염 완충 식염수	하이클론	RR14440.01	01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 대물렌즈	여러 공급업체
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 대물렌즈	여러 공급업체
프로나제	밀리포어 시그마	53702	프로테아제, 스트렙토마이세스 그리세우스
스콧의 수돗물	폴리 사이언티픽 R&D Corp.	s1887
Tissue-Tek 슬라이드 스테인 세트	피셔 사이언티픽	50-294-72
트윈-80	밀리포어 시그마	P1754
크실렌	피셔 사이언티픽	X3S-4	조직학적 등급
Zeiss Axioplan 2 이미징 - 현미경	여러 공급업체

(영어) 호 시리즈 년 ) 년 호 (영문)