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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 측두동맥 생검을 받은 후 조직병리학적 준비 및 처리
참고: 측두동맥 생검(TAB)은 공인된 외과의에 의해 국소 마취 및 멸균 상태에서 수행됩니다. 더 영향을 받은 쪽에서 3cm의 동맥 단면을 외과적으로 채취한 후, 표본을 즉시 포르말린에 24시간 동안 고정하고 3-4mm 절편으로 나누어 파라핀에 삽입한 다음 실온에서 보관한 블록 내 조직의 적절한 정렬에 주의를 기울입니다. 검체 선택은 의료 기록을 확인한 후 수행됩니다. 진단은 American College of Rheumatology 1990 기준을 기반으로 하며, 피험자는 50세 >세, 새로운 두통, 측두동맥 압통, Westergren 방법에 의한 적혈구 침강 속도>50mm/hour 및 비정상적인 TAB의 5가지 영역 중 3가지를 충족해야 합니다. 안전을 위해 표본을 다룰 때는 항상 보호 장갑을 착용해야 합니다. 화학 물질 및 항체.
- 내장된 블록에서 마이크로톰을 사용하여 4-5μm 두께의 절편을 자릅니다. Hematoxylin 및 Eosin(H&E)으로 염색합니다. 품질 보증을 위해 선택한 정상 조직의 대조 섹션을 사용하십시오.
- 40°C로 가열된 따뜻한 수조에 절단 부분을 띄워 주름을 제거하고 코팅된 유리 현미경 슬라이드로 집어냅니다.유리 슬라이드를 60°C 오븐의 따뜻한 접시에 60분 동안 올려 건조시키고 슬라이드에 섹션을 접착
할 수 있도록 합니다.
- 유리 슬라이드를 60°C 오븐의 따뜻한 접시에 60분 동안 올려 놓아 슬라이드를 건조시키고 슬라이드에 섹션을 쉽게 부착할 수 있도록 합니다.
- 현미경 슬라이드에 3개의 섹션을 장착합니다.
- 슬라이드를 수직 랙에 놓고 37°C에서 24시간 동안 밤새 건조합니다.
- 슬라이드를 용기에 넣고 4°C에서 보관합니다.
2. 면역조직화학 제제, 탈왁스, 항원 회수 및 염색
- 슬라이드를 슬라이드 랙에 로드합니다. 다음과 같이 접시를 통해 랙을 실행하십시오 : 100 % 자일렌에서 30 초마다 10 초간 부드럽게 교반하면서 5 분 동안 두 번, 10 초 교반으로 100 % 에탄올에서 한 번, 10 초 교반으로 90 % 에탄올에서 한 번, 10 초 교반으로 70 % 에탄올에서 한 번, 10 초 교반으로 이중 증류 H2O에서 두 번.
메모: 크실렌 및 아세톤의 취급은 흡입 및 호흡기 독성을 피하기 위해 환기가 잘 되는 후드에서 수행해야 합니다.
- 200mL의 10mmol/L, pH 6.0 시트르산 완충액이 95°C로 예열된 유리 용기에 랙을 옮겨 항원을 회수합니다. 수조에서 타이머를 30분으로 설정한 다음 실온에서 20분 동안 식힌 다음 흐르는 물로 5분 동안 헹굽니다.
- 200mL의 3% 과산화수소를 10분 동안 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 제거합니다. 200μL의 Tris-buffered saline solution(TBSS)에서 슬라이드를 3회 세척합니다.
- 랙에서 슬라이드를 제거하고 각 슬라이드를 부드럽게 두드려 여분의 버퍼를 닦아냅니다. 염색을 위해 다음 1차 항체 200μL를 첨가하고 슬라이드에 커버슬립을 추가한 후 습한 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
항엽산 수용체 베타(FRB) 항체 희석 1:800
단클론 마우스 안티 휴먼 CD68, 1:200 희석
다클론 토끼 항-CD3 1:100 희석
메모: 포르말린이 고정된 파라핀이 함유된 태반 절편도 2.1단계 내지 2.9단계에 설명된 대로 처리하고, 항-FRB18과 함께 배양하고, 양성 대조군으로 사용하였다. 염색 결과는 최적의 항체 농도를 찾아 얻었으며 항체를 이중 희석(예: 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600)으로 적정하여 수행했습니다.
- 배양 후 커버슬립을 제거하고 폐기하십시오. TBSS로 슬라이드를 각각 3분씩 2회 헹구고 물기를 빼고 여분의 버퍼를 닦습니다.
- 조직 항원에 결합된 접합되지 않은 1차 항체와 반응하기 위해 biotinylated Anti-Rabbit/Mouse 2차 항체를 함유한 200μL의 2차 항체 용액을 추가합니다. 슬라이드에 커버슬립을 놓고 실온에서 45분 동안 습한 챔버에서 배양합니다.
- 배양 후 커버슬립을 제거하고 폐기하십시오. TBS로 슬라이드를 각각 2분씩 3회 헹구고 물기를 빼고 여분의 버퍼를 닦습니다.
- 200μL의 디아미노벤지딘(DAB)+기질 완충액(Imidazole HCl)-발색 시스템을 추가하고 10분 동안 배양하여 염색 패턴을 시각화합니다. TBSS로 씻은 다음 흐르는 수돗물에 10분 동안 씻습니다.
- 헤마톡실린으로 3분 동안 반염색합니다.
- 슬라이드 표면에 70μL의 장착 매체를 적용하여 슬라이드를 장착합니다. 커버슬립을 장착 매체에 천천히 기울이고 제자리에 내릴 때 기포가 생성되지 않도록 합니다. 마를 때까지 24시간 동안 기다립니다.
3. 조직병리학 및 면역조직화학(IHC) 분석
광학 현미경을 사용하여 GCA 양성 및 정상 피험자의 H&E 및 IHC 염색 단면을 검사합니다.
- H&E 스테인드 섹션용
- 혈관 구조를 평가하고 tunica intima의 내피 세포, tunica media의 평활근 세포, tunica adventitia의 섬유아세포 및 vasa vasorum을 식별합니다.
- 림프구 및 대식세포/조직세포 침투, 세포 증식, 내부 탄성 층막 분해를 포함한 GCA 특징을 식별합니다.
- 림프구에 대한 대식세포의 수를 식별하고 정량화하여 림프조직세포 침투를 분석합니다. 상주 세포에서 내부 탄성 얇은 판 파괴 및 과형성 변화의 정도를 평가하고 대조군과 비교합니다.
- IHC 스테인드 섹션용
- FRB의 염색 패턴을 조사하고, 특정 유형의 세포에 의한 발현, 혈관층 내 분포 및 전체 면역 침투, 총 대식세포 마커, 항-CD68 및 범림프구 마커 항 CD3와의 관계를 주목합니다.
- 10개의 무작위로 선택된 hpf(High Power Field)에서 양성 염색된 세포를 계수하여 FRB, CD68 및 CD3 세포의 발현을 정량화하고 평균을 기록합니다.
메모: 이러한 정상 및 병리학적 세포와 구조의 확인은 공인된 심혈관 병리학자 및 류마티스 전문의에 의해 수행되었으며, 그 결과는 모든 사례에 대해 기록되었습니다.
- 디지털 카메라를 사용하여 대표적인 이미지를 캡처합니다.
참고: 이 단계 후에 남은 부분 표본은 -80°C에서 보관할 수 있습니다.