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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 조직 채취 및 UV 가교
- 이산화탄소(CO2)를 사용하여 성체 마우스 2마리를 1-2분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 안락사시킵니다. 다음으로, 각 마우스에서 경추 탈구를 수행합니다.
- 각 면역침전 실험에 대해 적절한 연령의 마우스(이 연구에서는 성인 고환 1개)에서 약 100mg의 고환을 채취하고 조직을 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣습니다.
- 끝이 가는 핀셋 한 쌍으로 tunica albuginea를 부드럽게 제거합니다.
- 티슈 그라인더에 얼음처럼 차가운 PBS 3mL를 넣고 느슨한 유리 유봉(A형 유리 유봉)을 사용하여 약한 기계적 힘으로 조직을 분쇄합니다.
참고: 이 단계의 목적은 세포를 용해하는 것이 아니라 조직을 분리하는 것입니다. 세포 생존력과 무결성을 보존하는 것이 중요합니다.
- 조직 현탁액을 세포 배양 접시(직경 10cm)로 옮기고 얼음처럼 차가운 PBS를 최대 6mL까지 첨가합니다.
- 액체가 접시 바닥을 고르게 덮도록 접시를 빠르게 흔듭니다. 조직이 제대로 분쇄되면 고르게 분포된 정세관이 보이는 반면, 조직 덩어리가 있다는 것은 조직 분산이 최적이 아님을 나타냅니다.
- 얼음 위의 254nm에서 400mJ/cm2로 서스펜션을 세 번 가교합니다. 각 조사량 사이에 현탁액을 혼합합니다.
메모: 각각의 새로운 실험에 대해 가교결합을 최적화해야 합니다.
- 15mL 원뿔형 튜브에 현탁액을 넣고 1,200 x g에서 4°C에서 5분 동안 펠렛으로 수집합니다. 상등액을 제거하고 1mL의 PBS에 펠렛을 재현탁한 다음 현탁액을 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C, 1,000 x g에서 2분간 회전한 후 상층액을 제거합니다.
- 이 시점에서 나머지 프로토콜은 즉시 진행하거나 펠릿을 액체 질소에 급속 동결하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
2. 구슬 준비
- 시료(펠릿)당 125μL의 단백질 A 마그네틱 비드를 새 원심분리기 튜브에 추가합니다.
메모: 마우스 항체에는 단백질 G 마그네틱 비드를 사용합니다.
- 자석에 튜브를 올려 용액에서 비드를 분리합니다. 10초 후 상층액을 제거합니다. 1mL의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼로 비드를 두 번 세척합니다.
메모: 단백질 A 자성 비드의 후속 분리는 이 단계를 따릅니다. 용해 완충액 조성은 50 mM Tris-HCl, pH 7.5입니다. 100mM 염화나트륨; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트; 1/50 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 없는 프로테아제 억제제 칵테일(신선 추가).
- 100 μL의 저온 용해 버퍼에 10 μg eCLIP 항체를 사용하여 비드를 재현탁합니다. 실온에서 튜브를 45분 동안 회전합니다.
메모: 면역침전을 위한 최종 항체 농도는 10μg/mL입니다. 항체 농도를 알 수 없는 경우 항체의 양을 최적화해야 합니다.
- 1mL의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼로 비드를 두 번 세척합니다.
3. 조직 용해 및 부분 RNA 분해
- 조직 펠릿을 1mL의 저온 용해 완충액에 재현탁합니다(1mL의 용해 완충액에 22μL의 50x(EDTA)-free 단백질 억제제 칵테일 및 11μL의 RNase 억제제 추가).
- 실험 그룹당 2개의 UV 가교 펠릿과 2개의 비가교 펠릿을 재현탁: eCLIP 라이브러리용 UV-가교-1 펠릿(UV-1); eCLIP 라이브러리용 UV-crosslinked-2 펠릿(UV-2); 대조군으로서의 eCLIP 라이브러리용 비가교-1 펠릿(비UV); 항체의 특이성을 입증하기 위한 IgG IP에 대한 비가교-2 펠릿.
메모: UV 가교 와이드 타입 고환의 eCLIP 라이브러리에 대한 이상적인 제어는 동일한 깔짚의 마우스에서 UV 가교 결합 녹아웃 고환을 제어하는 것입니다.
- 샘플을 얼음 위에서 15분 동안 계속 용해시킵니다(단백질과 RNA의 분해를 방지하기 위해).
- 디지털 초음파 발생기에서 10% 진폭으로 5분 동안 초음파 처리, 30초 켜기/30초 끄기. 항상 샘플을 얼음 위에 놓고 각 샘플 사이에 뉴클레아제가 없는 물로 프로브를 청소합니다.
- 각 튜브에 4μL의 DNase를 넣고 잘 섞습니다. 37°C에서 10분간 배양하고 1,200rpm으로 흔듭니다.
- 10 μL의 희석된 RNase I(PBS의 경우 4 U/μL RNase I)를 넣고 잘 섞습니다. 37°C에서 5분 동안 배양하고 1,200rpm으로 흔듭니다.
- 15,000 x g에서 20분 동안(4°C에서) 원심분리하여 용해물을 세척합니다.
- 상층액을 조심스럽게 모으십시오. 50μL의 용해물을 남기고 펠릿을 함께 버립니다.
- 입력 샘플을 RWB(웨스턴 블롯에 대해 실행) 및 RRI(RNA 분리에 대해 실행)로 저장합니다. UV-1, UV-2, non-UV 및 IgG 시료 20μL(2%)를 RWB 겔 로딩을 위한 입력으로 저장합니다. 20μL(2%)의 UV-1 또는 UV-2 시료를 RRI 겔 로딩을 위한 입력으로 저장합니다.
4. 면역침전
- 1mL의 용해물(단계 3.7)을 비드(섹션 2에서 준비)에 추가하고 샘플을 4°C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 회전시킵니다.
- 마그네틱 스탠드로 구슬을 모으고 상층액을 버립니다. 900 μL의 고염 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 % NP-40, 0.1 % SDS, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트)으로 비드를 두 번 세척 한 다음 900 μL의 세척 버퍼 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 0.2 % Tween-20)로 비드를 두 번 세척합니다 .
메모: IgG 샘플의 경우 여기에서 절차를 일시 중지하고 세척 버퍼의 얼음에 보관하십시오.