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방법 논문

항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포주기 분석을 위한 분석

861 조회수

⸱

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

출처: Simonetti, S., et al. 백신 접종 마우스에서 항원 특이적 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을 위한 DNA/Ki67 기반 유세포 분석 분석. J. Vis. 특급 (2021)

이 동영상은 다양한 세포주기 단계에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분석하는 분석을 보여줍니다. 형광 표지된 생존 세포는 유세포 분석을 사용하여 선택되며, 세포 증식 관련 핵 단백질 및 핵산 염색에 대한 항체를 사용하여 서로 다른 세포 주기 단계에 있는 세포를 DNA 함량으로 식별합니다.

프로토콜

1. 배지 및 염색 용액의 준비

  1. 완전한 배지 준비: 2mM 글루타민, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 베타-메르캅토에탄올 및 10% 부피/부피(v/v)의 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지
  2. 염색 완충액 준비: 1% 중량/부피(w/v) 소 혈청 알부민(BSA) 및 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨염(EDTA)이 포함된 Ca2+/Mg2+(PBS)가 없는 인산염 완충 식염
    3. 수

2. 마우스 처리

  1. 프라임 7-8 주령, 암컷 Balb / c 마우스 근육 내 (i.m.) 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -1 gag-expressing-chimpanzee adenoviral vector (ChAd3-gag)의 대퇴사 두근에 107 바이러스 입자의 투여량으로.
  2. 프라이밍 후 1-4 개월에, 106 플라크 형성 단위의 복용량으로 HIV-1-개그 표현 변형 vaccinia 앙카라 바이러스 (MVA-개그)의 IM 주입에 의해 마우스에 한 번 부스트
    3. .
  3. 부스트 후 3일차에 경추 탈구로 인해 부스트된 마우스를 희생하고 처리되지 않은 마우스와 병행하여 분석합니다.
  4. 대퇴사두근(장골, 슬와골 및 서혜부)과 비장을 배출하는 림프절(LN)을 boosted 및 untreatment 마우스에서 수확합니다. 또한, 처리되지 않은 마우스의 두 뒷다리에서 골수(BM)를 채취하고, 이 BM을 유세포 분석기 설정 및 세포 주기 분석을 위한 양성 대조군으로 사용합니다(그림 1).
    메모: 앞에서 설명한 대로 ChAd3-gag 및 MVA-gag 벡터를 생성합니다.

3. 배수 LN, 비장의 격리

  1. 비장과 LN 세포의 분리
    1. 두 개의 15mL 튜브 각각에 5mL의 완전한 배지를 놓고 장기를 채취할 수 있도록 얼음 위에 보관합니다.
    2. 자궁 경부 탈구로 성인 쥐를 희생시킵니다.
    3. 마우스를 등에 눕히고 70% v/v 에탄올로 피부 표면을 살균합니다.
    4. 서혜부 LN을 채취하려면 가위로 복부를 ~1cm 세로 절개하고 집게로 절개 부위를 늘립니다.
    5. 피부 내부 표면의 서혜부 LN을 시각화하고 겸자로 채취합니다. 3.1.1단계에서 준비한 두 개의 15mL 튜브 중 하나에 서혜부 LN을 놓습니다.
    6. 비장을 채취하려면 가위로 복막을 절개하고 비장을 제거합니다. 주변 결합 조직을 절단한 후 3.1.1단계에서 준비한 두 번째 15mL 튜브에 비장을 넣습니다.
    7. 장골 LN을 수집하려면 장을 옆으로 이동하고 장골 LN을 하대정맥에 가깝게 시각화한 다음 겸자를 사용하여 수집합니다. 서혜부 LN이 들어 있는 동일한 튜브에 장골 LN을 놓습니다.
      메모: 염색을 위한 충분한 LN 세포를 얻기 위해(섹션 4 참조) 한 마우스에서 슬와울, 서혜부 및 장골 LN을 풀링해야 하는 경우가 많습니다. 이 LN은 모두 대퇴사두근(i.m. 백신 접종 부위)을 배출하고 있습니다. 이 프로토콜은 15mL 튜브의 풀링된 LN을 하나만 사용합니다.
    8. 슬와골을 모으려면 뒷다리의 피부를 잡고 부드럽게 아래로 당겨 근육을 드러냅니다. 그런 다음 무릎 관절 아래 근육 사이에 집게를 삽입하고 슬와골 LN을 수집합니다. 서혜부 및 장골 LN이 들어 있는 동일한 튜브에 슬와골 LN을 놓습니다.
      메모: 3.1.7 이후의 참고 사항을 참조하십시오.
    9. 비장을 5mL의 완전한 배지로 채워진 60mm 배양 접시 내의 70μm 세포 여과기에 넣습니다. 5mL 주사기 플런저를 사용하여 장기가 완전히 분해될 때까지 부드럽게 으깬다.
    10. 스트레이너를 제거하고 세포 현탁액을 깨끗한 15mL 튜브로 옮깁니다.
    11. 배양 접시에 5mL의 완전한 배지를 추가하고 접시와 여과기를 조심스럽게 세척하여 모든 세포가 회수되었는지 확인합니다. 나머지 비장 세포 현탁액과 함께 15mL 튜브에 풀링합니다.
    12. 풀링된 서혜부, 장골 및 슬와석 LN의 경우, 비장에 대해 3.1.9 - 3.1.11 단계에서 사용된 것과 유사한 절차에 따라 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
    13. 400 × g에서 4 °C에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 PBS에 재현탁합니다.
    14. 적혈구 용해 완충액과 PBS에서 0.04% v/v 트리판 블루를 사용하여 Neubauer 챔버로 세포를 계수합니다.

4. 비장의 염색, LN

  1. 염색할 세포 샘플을 3개의 하위 그룹으로 나눕니다: Hoechst 33342(이하 Hoechst라고 함)로만 염색할 처리되지 않은 마우스의 BM 세포를 포함한 보상을 위한 세포 샘플, 및 사멸 세포 염료 보상을 위한 사한/살아있는 세포 혼합물을 준비하는 데 사용할 처리되지 않은 마우스의 비장 세포; 치료되지 않은 마우스의 BM 샘플로 구성된 세포주기 분석을 위한 양성 대조군; 치료되지 않은 마우스와 백신을 접종한 마우스의 비장 및 LN 샘플을 포함하는 실험 샘플.
    메모: 충분한 수의 gag 특이적 CD8 T 세포를 분석하기 위해 충분한 비장 및 LN 세포가 있는지 확인합니다. 백신을 접종한 3마리의 마우스에서 풀링된 비장 세포와 풀링된 LN 세포를 사용하고 각각 3 × 106개의 세포를 포함하는 풀링된 세포의 2개 이상의 동일한 샘플을 염색해야 하는 경우가 많습니다. Hoechst 염색 단계에서 동일한 샘플을 병합합니다. 마찬가지로, 처리되지 않은 3마리의 마우스에서 풀링된 비장 세포와 LN 세포를 염색하고 끝에서 동일한 샘플을 병합합니다. 기기 및 보상 설정에 사용하기 위해 처리되지 않은 마우스의 염색되지 않은 비장 세포 샘플을 따로 보관하십시오.
  2. 사세포 염료 보상을 위해 사각/살아있는 세포 혼합물을 준비합니다(이 세포 혼합물은 사세포 염료로만 염색됨).
    1. 수조를 65 °C로 가열합니다.
    2. 비장 세포의 분취액을 취합니다(~3 × 106).
    3. 세포 현탁액을 마이크로분리관으로 옮기고 65°C의 수조에 5분 동안 넣은 다음 즉시 얼음 위에 10분 동안 놓습니다.
    4. 열에 의해 사멸된 세포를 살아있는 비장 세포(~3 × 106)와 1:1의 비율로 혼합하고, 혼합물의 절반을 96 웰 라운드 바닥 플레이트(사멸 세포 염색 대조군의 경우 ~3 ×10 6 셀/웰)로 옮깁니다.
  3. 실험 샘플의 사체 염색, 세포 주기 분석을 위한 양성 대조군 및 사세포/살아있는 세포 혼합
    1. 염색 계획(단계 4.1)에 따라 비장, LN, BM 세포(3 ×10 6 세포/웰) 및 사상/살아있는 세포 혼합물(섹션 4.2)을 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮기고 400°C에서 3분 동안 400×g에서 원심분리합니다.
    2. PBS에 희석된 50 μL의 사체 염료에 각 세포 펠렛을 재현탁하고, 즉시 위아래로 3회 피펫팅하여 재현탁합니다.
    3. 빛으로부터 보호받으며 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.
    4. 염색 완충액으로 세포를 2회 세척합니다. 첫 번째는 200μL로, 두 번째는 250μL로 세척합니다. 각 세척에 대해 400 ° C에서 3 분 동안 4 × g의 플레이트를 원심 분리합니다.
    5. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 20μL의 PBS에 재현탁합니다.
  4. 주요 조직적합성 복합체(MHC)-펩타이드 멀티머 및 단클론 항체(mAb)를 사용한 멤브레인 세포 염색.
    1. 염색 계획(유세포 분석기 설정, 표 1)에 따라 필요한 부피를 고려하여 다음 시약을 준비합니다.
      1. 적절한 희석액에 따라 염색 완충액에서 mAb 2.4G2를 희석합니다(재료 표 참조). 염색할 각 샘플에 대해 이 희석액 10μL를 사용합니다.
        참고: 2.4G2 mAb는 FcγIII 및 FcγII 수용체에 대한 면역글로불린의 비항원 특이적 결합을 차단합니다.
      2. 염색 완충액에서 H-2k(d) AMQMLKETI 알로피코시아닌(APC) 표지 테트라머(Tetr-gag)를 희석하여 적절한 희석액을 얻습니다(재료 표 참조). 염색할 각 샘플에 대해 이 희석액 20μL를 사용합니다.
      3. 이전에 적정 실험에서 결정된 적절한 희석액(Table of Materials)에 따라 염색 완충액에서 mAbs를 희석하여 항체 혼합물을 준비합니다. 염색할 각 샘플에 대해 이 항체 혼합물 20 μL를 사용합니다.
        메모: 여기서, 항-CD3e 페리디닌 엽록소 단백질(PerCP-Cy5.5)(클론 145-2C11), 항-CD8a 브릴리언트 자외선(BUV805)(클론 53-6.7) 및 항-CD62L 피코에리트린 시아닌7(PECy7)(클론 MEL-14)을 사용하였다.
    2. 이전에 희석된 2.4G2 mAb 10μL를 추가하고(단계 4.4.1.1), 빛으로부터 보호된 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
    3. 이전에 희석된 Tetr-gag APC 20μL(단계 4.4.1.2)와 H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrin(PE) pentamer(pent-gag) 10μL를 추가합니다. 빛으로부터 보호된 4 °C에서 15분 동안 배양합니다.
    4. 이전에 준비된 항체 혼합물 20 μL를 추가하고(단계 4.4.1.3), light.
      로부터 보호되는 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 메모: 따라서 최종 부피는 웰당 80μL입니다(단계 4.3.5, 단계 4.4.2 - 4.4.4).
    5. 200μL의 염색 완충액으로 세포를 세척합니다. 400 × g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
    6. 세포 펠릿을 250μL의 염색 완충액에 재현탁하고 세포 현탁액을 5mL 튜브로 옮깁니다. 튜브에 염색 완충액 1mL를 추가하고 400 × g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. Hoechst 채널(Hoechst 33342는 자외선 레이저에 의해 여기됨(유세포 분석기 설정(표 2))을 보상하는 데 사용할 BM 세포(3 × 106 세포)(세포 샘플 목록, 섹션 4.1 참조)의 분취액을 취하고 세포 현탁액을 5mL 튜브로 이동합니다. 튜브에 염색 완충액 1mL를 추가하고 4°C에서 5분 동안 400×g을 원심분리합니다.

5. 고정/투과화

  1. 제조업체의 지침에 따라 고정/투과화 농축액 1부와 고정/투과화 희석제 3부를 희석하여 새로운 고정/투과화 완충액을 준비합니다.
  2. 상등액을 버리고 샘플을 펄스 와류로 만들어 펠릿을 완전히 분해합니다.
  3. 염색되지 않은 비장 세포(3 x 106, 세포 샘플 목록, 섹션 4.1 참조) 및 와류가 있는 튜브를 포함하여 새로 준비된 고정/투과화 완충액 1mL를 각 튜브에 추가합니다.
  4. 4 ° C에서 16 시간 동안 배양하십시오 .
    메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

6. 세포 내 염색

  1. Ki67 염색
    1. 제조업체의 지침에 따라 투과화 완충액 10x를 증류수로 희석하여 신선한 투과화 완충액 1x를 준비합니다. 사용하기 전에 투과화 완충액 1x를 0.45μm 필터를 통해 여과하여 응집체를 제거해야 합니다.
    2. 이전에 적정 실험에서 측정한 바와 같이 투과화 완충액 1x(시료당 100μL의 최종 부피)에서 mAb Ki67 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(클론 SolA15)를 희석합니다.
    3. 각 튜브에 투과화 완충액 3mL를 1x 첨가하고 실온(RT)에서 400×g으로 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 상등액을 버리고 6.1.3단계를 반복합니다.
    5. 상층액을 버리고 이전에 희석된 mAb Ki67 FITC의 100μL에 세포 펠릿을 재현탁합니다(단계 6.1.2).
    6. RT에서 30분 동안 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
    7. 투과화 완충액 4mL로 세포를 2회 세척합니다. 각 세척 원심분리기에 대해 400×g에서 RT에서 5분 동안 원심분리기.
    8. 다음 부피를 고려하여 PBS에서 세포 펠릿을 재현탁합니다: 유세포 분석기에서 직접 획득할 샘플의 경우 350μL의 PBS;유세포 분석 직전에 Hoechst로 배양할 샘플의 경우 250μL의 PBS(섹션 6.2).
  2. DNA 염색
    1. 각 샘플에 PBS의 4μg/mL Hoechst 250μL를 추가합니다(Hoechst의 최종 농도는 2μg/mL임).
      참고: PBS에서 250μL의 동일한 샘플이 두 개 이상 준비된 경우 이 단계에서 병합하고 PBS에 동일한 부피의 4μg/mL Hoechst 용액을 추가합니다(Hoechst의 최종 농도는 2μg/mL임). 세포의 수는 DNA 염색 단계에 큰 영향을 미칩니다. 각 표본에서 동일한 셀 번호를 사용합니다. 세포 수가 약간 감소하더라도 (예: 이전 세척 단계에서의 세포 손실로 인해) DNA에 대한 Hoechst 결합이 더 높아지고 Hoechst 강도가 높아진다는 점에 유의하십시오.
    2. RT에서 15분 동안 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
    3. 400 × g에서 RT에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.
    4. 세포 펠릿을 350μL의 PBS에 재현탁합니다.

7. 보상 비드 샘플 준비

  1. 염색 완충액에서 mAb를 적절하게 희석하여 항체 5μL를 준비합니다.
    메모: 실험에 사용된 각 형광색소 복합 mAb에 대해 해당 보상 비드 샘플을 준비합니다.
  2. Vortex Negative Control 및 Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp 비드 사용 전.
  3. 각 샘플에 대해 Negative Control CompBeads 1방울(~20μL)과 Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads 1방울을 주입합니다.
  4. prediluted antibody 5 μL를 튜브에 추가하고(step 7.1) 위아래로 피펫을 주입합니다.
  5. 빛으로부터 보호된 4 °C에서 15분 동안 배양합니다.
  6. 2mL의 염색 완충액으로 샘플을 세척합니다. 400 × g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
  7. 상층액을 버리고 각 튜브와 와류에 500μL의 PBS를 추가하여 펠릿을 재현탁합니다.

8. 유세포 분석기에서 기기 및 보상 설정 및 실험 샘플 수집

참고: 유세포 분석기 구성에 대해서는 유세포 분석기 설정(표 2)을 참조하십시오.

  1. 일반 기기 및 보정 설정
    1. 샘플 수집을 위해 소프트웨어를 열고(Table of Materials 참조) 작업 공간 리본 섹션에서 New Experiment를 클릭하고 New Blank Experiment를 선택하여 새 실험을 만듭니다.
    2. 생성된 실험을 두 번 클릭하여 엽니다.
    3. Cytometer Settings 창에서 Parameters를 클릭하고 FSC(Forward Scatter) 및 SSC(Side Scatter) 매개변수를 포함하여 염색 패널에 사용된 모든 채널(예: PE, APC 등)을 선택합니다.
    4. 로그 스케일을 선택 취소하여 Hoechst 매개변수로 선형 스케일을 선택하고 FCS, SSC 및 Hoechst에 대한 전압 펄스의 너비(W)를 확인합니다.
      메모: 선형 스케일인 FSC 및 SSC를 제외한 모든 매개변수는 기본적으로 로그(로그) 스케일에 표시됩니다. 모든 매개변수는 전압 펄스의 영역(A)과 높이(H)로 분석됩니다.
    5. 글로벌 워크시트에서 x축에 FSC-A, y축에 SSC-A를 포함하는 점도표를 만듭니다.
    6. Acquisition Dashboard에서 Acquire Data를 클릭하여 염색되지 않은 비장 샘플을 실행합니다.
    7. 매개변수 섹션에서 전압 값을 수정하여 셀을 시각화하도록 적절한 FSC 및 SSC 설정을 지정하고, 글로벌 워크시트의 작업 공간 도구 모음에서 폴리곤 게이트를 클릭하여 FSC-A/SSC-A 도트 플롯에 표시된 모든 셀을 선택하는 게이트를 만듭니다.
    8. gated cells를 x축에 각 형광 매개변수와 함께 히스토그램으로 표시합니다.
    9. 염색되지 않은 비장 샘플과 완전히 염색된 비장 샘플을 실행하여 형광 검출기(PMT)를 조정하여 각 형광 파라미터에 대해 염색된 세포의 음성 신호와 양성 신호를 명확하게 분리합니다.
    10. 보정 설정을 수행하려면 작업 공간 리본에서 실험을 클릭하고 보정 설정 섹션에서 보정 컨트롤 만들기를 선택합니다. Include unstained control tube/well(염색되지 않은 제어 튜브/웰 포함)을 선택 취소하고 OK를 클릭합니다.
      메모: 이 작업을 통해 Compensation Controls라는 표본과 선택한 각 매개변수에 해당하는 여러 시트가 포함된 Normal Worksheet가 생성됩니다.
    11. compensation beads 샘플을 실행하고(section 6 참조), Cytometer window에서 FSC 매개변수의 전압 값과 수집 임계값 5,000을 수정하여 비드를 시각화하기 위한 적절한 FSC 및 SSC 설정을 설정합니다.
    12. 비드 모집단에서 P1 게이트를 조정하고 양수 피크와 음수 피크가 모두 x축에서 보이는지 확인합니다. 각 보상 비드 샘플에 대해 이 작업을 반복하고 마지막으로 Acquisition Dashboard에서 Record Data를 클릭하여 각 샘플 파일을 기록합니다(각 샘플에 대해 최소 5,000개의 이벤트 기록).
    13. 기록된 각 비드 샘플에 대해 P2 및 P3 게이트를 각각 양수 및 음수 피크에 설정합니다.
    14. 보정을 위해 세포 샘플을 실행합니다(4.2 및 4.4.7 단계와 섹션 5 및 6 참조). FSC 및 SSC 전압과 임계값을 수정하여 셀을 시각화하고, P1 게이트를 조정하고, 마지막으로 각 샘플 파일을 기록합니다(최소 10,000개의 이벤트 기록). P2 게이트와 P3 게이트를 각각 양수 피크와 음수 피크에 설정합니다.
      메모: Hoechst 채널의 보정을 위해 G0/G1을 음의 피크(P3)로 사용하고 G2/M을 양의 피크(P2)로 사용합니다.
    15. 워크스페이스 리본 섹션에서 Experiment를 클릭하고 Compensation Setup 섹션에서 Calculate Compensation을 선택합니다.
    16. 생성된 보정 설정의 이름을 지정하고 링크를 지정한 다음 현재 실험에 저장합니다.
  2. 실험적 시료 채취
    1. 브라우저 도구 모음에서 새 표본을 클릭하여 표본을 열고 전역 워크시트에서 게이팅 전략을 만듭니다.
      메모: 샘플 수집의 게이팅 전략은 그림 2 및 섹션 9에 설명된 샘플 분석의 게이팅 전략과 유사합니다.
    2. x축에 CD3-A가 있는 히스토그램에 모든 이벤트 모집단을 표시합니다. CD3+ 셀만 선택하는 간격 게이트를 만듭니다.
    3. Acquisition Dashboard에서 LN 샘플에 대해 All Events로 storage gate를 선택하고, 비장 샘플에 대해 All Events 또는 CD3+ cells를 선택합니다.
    4. 실험 샘플을 저속으로 실행하고 마지막으로 백신을 접종한 마우스에서 각 샘플에 대해 최소 100-200개의 항원 특이적 CD8 T 세포를 수집하도록 모든 파일을 기록합니다.
      메모: 실험 샘플의 파일 크기는 일반적으로 크며(30-120MB), 특히 항원 특이적 CD8 T 세포의 빈도가 낮을 때 그렇습니다. 따라서 최소 100-200개의 항원 특이적 CD8 T 세포를 기록하기 위해 많은 수의 이벤트(> 1 × 106)를 수집해야 합니다. 파일이 크면 후속 데이터 분석 프로세스의 속도가 느려질 수 있습니다. 비장 샘플에서 CD3+ 세포만 획득하면(위의 8.2.2 단계 참조) 파일 크기를 더 작게 유지하는 데 도움이 됩니다.
    5. 세포주기 분석을 위한 positive control, 즉 처리되지 않은 마우스의 BM 샘플을 실행하고 기록합니다.

9. 데이터 분석

  1. 소프트웨어를 열고(재료 표 참조) 작업 공간 리본 섹션에서 그룹 생성을 클릭하여 분석할 다른 장기에 해당하는 다른 그룹을 만듭니다(즉, 그룹 "a-LNs", "b-spleen", "c-BM" 생성).
    메모: 새로 생성된 그룹은 그룹 목록에 나타나고 "보상" 그룹은 소프트웨어에 의해 자동으로 생성됩니다.
  2. 그룹 이름을 두 번 클릭하여 Modify Group(그룹 수정) 창을 열고 새로 생성된 그룹이 동기화되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 Synchronized 함수에 확인 표시를 삽입합니다.
  3. 각 .fcs 파일을 해당 그룹으로 드래그합니다.
  4. "a-LNs" 그룹부터 시작하는 게이팅 전략을 만듭니다.
  5. 그룹에서 완전히 염색된 샘플을 두 번 클릭하여 그래프 창을 엽니다. x축과 y축은 fcs 파일에서와 같이 레이블이 지정됩니다(유세포 분석기 설정, 표 2 참조).
  6. 이 샘플에 대해 획득한 총 이벤트를 x축에 DNA-A, y축에 DNA-W를 사용하여 점도표로 표시합니다.
  7. 그래프 창의 게이팅 도구 섹션에서 사각형을 클릭하여 단일 셀 모집단만 선택합니다.
    메모: 단일 세포는 다음과 같은 DNA-A 값을 가지고 있습니다: 2N(낮음): 2N에서 4N(중간) 사이 또는 4N(높음)과 같음, DNA-W 값은 모두 동일합니다(그림 2의 1단계).
  8. 직사각형 게이트의 중앙을 두 번 클릭하면 X축에 FSC-A 매개변수가 있고 Y축에 데드 셀 염료가 있는 도트 플롯에 단일 셀이 표시됩니다.
  9. 그래프 창의 게이팅 도구 섹션에서 Polygon을 클릭하여 살아있는 세포 모집단만 선택합니다. 살아있는 세포는 사세포 염료에 대해 음성입니다(그림 2의 2단계).
  10. 다각형 게이트의 중심을 두 번 클릭하여 FSC-A 매개변수가 x축에, SSC-A 매개변수가 y축에 있는 도트 플롯에 셀을 표시합니다.
  11. Rectangle을 클릭하고 해당 그래프에 모든 단일 라이브 셀을 포함하도록 "편안한" 게이트를 만듭니다(그림 2의 3단계).
  12. "편안한" 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x축에 CD3, y축에 CD8이 있는 점도표로 셀을 표시합니다.
  13. 다각형을 클릭하여 CD3+CD8+ 셀을 선택합니다(그림 2의 4단계).
  14. CD3+CD8+ 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x축에 Tetr-gag, y축에 Pent-gag를 사용하여 셀을 도트 플롯에 표시합니다.
  15. Polygon을 클릭하여 항원 특이적 CD8 T 세포(Tetr-gag 및 Pent-gag 모두에 양성)를 선택합니다(그림 2의 5단계).
  16. 개그 관련 게이트의 중앙을 두 번 클릭하면 x축에 DNA-A가 있고 y축에 Ki67이 있는 도트 플롯에 세포가 표시됩니다(그림 3).
  17. 그래프 창의 게이팅 도구 섹션에서 Quad를 클릭하여 다른 세포 주기 단계의 셀을 선택합니다.
    메모: G0 단계의 세포는 Ki67neg-DNA 저세포(왼쪽 하단 사분면)입니다. G1의 세포는 Ki67pos-DNA 낮음(좌측 상단 사분면)입니다. S-G2/M의 세포는 Ki67pos-DNA 중간/고급(오른쪽 상단 사분면)입니다(그림 3).
  18. 한 샘플에서 만든 게이팅 전략을 해당 그룹에 복사하여 그룹의 모든 샘플에 게이트를 적용합니다.
  19. "a-LN 그룹"에 대해 9.5단계부터 9.18단계까지 반복합니다.
  20. 모든 게이트가 "b-spleen" 그룹의 각 샘플에 적합한지 확인합니다. BM 세포 간의 세포 주기를 분석하려면(양성 대조군) "이완된" 게이트의 중앙을 클릭하여 x축에 DNA-A, y축에 Ki67이 있는 점도표로 세포를 표시합니다.
  21. 모든 게이트가 3개 그룹의 각 샘플(즉, 비장, LN 및 BM의 세포)에 적합한지 확인합니다.
    메모: 세포 주기에 대한 단일 세포 집단 게이트(단계 9.7) 및 쿼드 게이트(단계 9.17)는 주로 샘플 간의 Hoechst 염료 강도의 약간의 차이 가능성으로 인해 서로 다른 샘플에서 다른 게이트 좌표를 가질 수 있습니다(섹션 6.2). 이러한 이유로 각 샘플의 세포 주기에 대한 Single-cell population gate와 Quad gate를 수정해야 할 수 있습니다. 이 작업은 다음과 같이 수행됩니다: 그룹 이름을 두 번 클릭하고 그룹 속성에서 동기화를 제거합니다. 이 작업을 통해 그룹의 다른 모든 샘플에서 동일한 게이트를 수정하지 않고 한 샘플의 게이트를 수정할 수 있습니다. 동기화를 제거한 후 필요한 경우 게이트를 수정합니다.
  22. 이 분석에서 얻은 결과를 시각화하려면 작업 공간 리본 섹션에서 레이아웃 편집기를 클릭하여 엽니다. 샘플 분할창에서 게이팅 전략의 각 게이트를 레이아웃 편집기로 끌어 놓고 게이트 전략의 순서에 따라 플롯을 배치하십시오. 필요한 경우 레이아웃에서 해당 플롯을 두 번 클릭하고 그래프 정의 창에서 적절한 유형을 선택하여 그래프 유형을 변경합니다.
  23. 레이아웃 리본에서 Group and iterate by 기능을 클릭하여 각 기관에서 얻은 결과를 시각화하고 다른 샘플을 비교합니다.

표 1: 유세포 분석기 설정.

견본항체 패널
전체 스테인드Ki67 FITCCD3 퍼프사이5.5테트르 개그 APCFVD eFluor 780회스트: 33342CD8 BUV805펜트 개그 PE
Ki67 FMOCD3 퍼프사이5.5테트르 개그 APCFVD eFluor 780회스트: 33342CD8 BUV805펜트 개그 PE
테터개그 APC FMOKi67 FITCCD3 퍼프사이5.5FVD eFluor 780회스트: 33342CD8 BUV805펜트 개그 PE
펜트 개그 PE FMOKi67 FITCCD3 퍼프사이5.5테트르 개그 APCFVD eFluor 780회스트: 33342CD8 BUV805
CD8 FMOKi67 FITCCD3 퍼프사이5.5테트르 개그 APCFVD eFluor 780회스트: 33342펜트 개그 PE
CD3 FMOKi67 FITC테트르 개그 APCFVD eFluor 780회스트: 33342CD8 BUV805펜트 개그 PE
고정성 생존도 염료 FMOKi67 FITCCD3 퍼프사이5.5테트르 개그 APC회스트: 33342CD8 BUV805펜트 개그 PE
회스트: 33342 FMOKi67 FITCCD3 퍼프사이5.5테트르 개그 APCFVD eFluor 780CD8 BUV805펜트 개그 PE

표 2: 유세포 분석기 설정.

) 시리즈
악기BD LSR 포르테사
레이저 블루 488nm레드 639nm자외선 355nm옐로우/그린 561nm
대역통과 필터 530/3050분의 71014분의 67060분의 780530/3060분의 82015분의 58560분의 780
롱패스 필터505LP685LP750LP505LP770LP750LP
형광 색소/염료 사용FITC (영어PERCPCY5.5APC (에이피씨)e플루어 780회스트: 33342부브805체육페시7
fcs 파일의 해당 이름알렉사 플루어 488PERCPCY5.5APC (에이피씨)APC-H7Hoechst-레드부브737체육페시7

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결과

figure-results-1
그림 1: BM 세포의 세포주기 분석. 처리되지 않은 Balb/c 마우스의 BM 세포를 염색하고 유세포 분석법으로 분석했습니다. (A) 게이팅 전략의 예. DNA-A/-W 플롯(왼쪽)에서 단일 세포를 게이팅한 후 사세포 염료 배제(가운데)를 통해 살아있는 세포를 게이팅했습니다. 그런 다음 모든 BM 셀(오른쪽)에 대해 "완화된" FSC-A/SSC-A 게이트를 사용했습니다. (B) BM 세포의 세포주기 분석 예(왼쪽). 세포주기의 다음 단계에서 세포를 식별하기 위해 Ki67과 DNA 염색의 조합을 사용했습니다: G0 (좌측 하단 사분면, Ki67neg-DNAlow 세포), G1 (좌측 상단 사분면, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (우측 상단 사분면, ...

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공개 사항

선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-200 μL 범용 핏 벌크 패킹 피펫 팁코 닝CLS4866-1000개
2.4G2 안티 FcγR mAbBD (영어)55314110 μg/ml 최종 농도
5ml 주사기 플런저BD 에메랄드307733
15ml 원뿔형 튜브머크 밀리포어SBHA025SB
60mm TC 처리된 세포 배양 접시송골매353002
70 μm 세포 스트레이너송골매352097
96웰 투명 원형 바닥 TC 처리된 배양 마이크로플레이트송골매353077
안티 랫 / 햄스터 Ig, k / 네거티브 컨트롤 보상 입자BD- 생명과학552845
베타-메르캅토에탄올시그마M3148
소 세럼 알부민시그마A07030
BUV805 쥐 안티 마우스 CD8aBD- 생명과학5649204 μg/ml 최종 농도
Dulbecco's 인산염 완충제 칼슘 없음 식염수 마그네슘 없음유로클론ECB4004L
Eppendorf Safe-Lock 튜브, 1.5 mL에펜도르프30120159
에탄올시그마34852-1L-M
에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염 용액(EDTA)시그마E7889
소 태아 세럼코 닝35-079-CV
Filcon, 멸균, 주사기 타입 70 μm송골매352350
정착성 생존도 염료 eFluor 780이바이오사이언스Tel.: 65-0865-141:1000 최종 집중
Foxp3 / 전사 인자 염색 완충액 세트이바이오사이언스전화: 00-5523-00이 세트에는 고정/투과화 농축액 및 희석액, 투과화 완충액 10x가 포함되어
H-2k(d) AMQMLKETI 알로피코시아닌(APC) 표지 테트라머NIH Tetramer Core Facility 제공6 μg/ml 최종 농도
H-2k(d) AMQMLKETI 피코에리트린(PE) 표지 펜타머프로이뮨F176-2A-E - 17610 μL / 시료
Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트 - 물 속 10 mg/mL 용액써모피셔H3570
Ki-67 단클론 항체 (SolA15), FITC이바이오사이언스Tel.: 11-5698-825 μg/ml 최종 농도
L-글루타민 100X(200mM)유로클론ECB3000D
Millex-HA 필터 0,45 μmBD (영어)340606
페니실린/스트렙토마이신 100X유로클론ECB3001D
PE/Cyanine7 anti-mouse CD62L 항체바이오레전드1044180.2 μg/ml 최종 농도
PerCP-Cy™5.5 햄스터 안티 마우스 CD3eBD- 생명과학5511634.4 μg/ml 최종 농도
적혈구 용해 완충액시그마R7757
둥근 바닥 폴리스티렌 튜브, 5 mL송골매352058
RPMI 1640 페놀 레드가 함유된 L-글루타민이 없는 배지유로클론ECB9006L
유세포 분석 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어 패키지플로우조v.10
유세포분석기에서 시료를 수집하기 위한 소프트웨어BD FACS디바버전 6.2
Trypan 블루 솔루션유로클론ECM0990D
있습니다.

태그

유세포 분석법DNA Ki67 염색형광 생존 염색약항원성 펩타이드-MHC 멀티머투과화 세척 완충액Ki67-FITC 항체Hoechst DNA 염색약게이팅 전략
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