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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 사출 재료 준비
- 33G 바늘 및 주사기 살균: 115 °C에서 분해 및 고압멸균합니다. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 상승하여 주사할 바늘을 준비합니다.
- 형광 표지된 입자를 실온에서 5 - 10분 동안 해동합니다. 칼슘 이온 및 마그네슘 이온(Ca2+/Mg2+)이 있는 멸균 PBS에서 50mg/ml 용액으로 재구성하여 주입할 입자 용액을 준비합니다.
메모: 이 프로토콜에는 phagocytosis assay에 대해 검증된 진균 기원의 AF488 표지 입자가 사용됩니다. 최적의 흡수를 위해 주입 직전에 입자를 신선하게 준비하십시오.
참고 2: 입자 농도는 각 특정 실험에 대해 최적화될 수 있습니다.
2. 비드 용액의 유리체 내 주입
참고: 주사를 수행하는 사람은 마우스를 잡고 안구에 초점을 유지하는 동안 다른 사람은 장전된 주사기를 통과시키고 플런저를 밀 수 있는 방식으로 주사를 수행하려면 두 사람이 필요합니다.
- 체중 20μl/10g의 용량으로 100mg/ml 케타민과 10mg/ml 자일라진을 복강내 주사하여 설치류를 마취합니다. 주사 전에 발가락 꼬집음을 사용하여 마취 수준을 평가합니다.
메모: 이소플루란은 골수성 세포 기능에 지대한 영향을 미치므로 이 분석 전반에 걸쳐 사용하는 것은 피해야 합니다.
- 바늘에 0.5μl의 형광 표지된 입자 용액을 로드합니다.
- 수술용 현미경 아래에 마우스를 옆으로 눕힙니다(그림 1A-B). 마우스의 더 나은 위치를 위해 젤 팩과 같은 부드러운 소재를 사용하십시오. 눈이 아직 뜨지 않은 어린 쥐의 경우, 눈꺼풀이 결국 열릴 슬릿을 따라 균열을 만들어 미세한 45o 각도의 집게를 사용하여 눈꺼풀을 부드럽게 엽니다.
- 45°C의 미세한 각도 겸자를 사용하여 눈꺼풀 주위에 조심스럽게 압력을 가하여 안구가 눈구멍에서 약간 튀어나오도록 합니다. 두 손가락으로 귀 바로 위와 턱을 잡고 눈꺼풀과 평행하게 피부를 부드럽게 펴서 눈구멍에서 눈이 약간 나오지 않도록 합니다. 목구멍에 너무 가까이 잡지 않도록 주의하십시오(그림 1B).
- 안구에 구멍을 뚫으려면 주사기의 바늘을 각막 가장자리(각막과 공막이 연결되는 곳)에 삽입합니다. 이것은 착색된 마우스에서 회색 원으로 볼 수 있습니다. 바늘을 약간 집어넣어 소량의 유리체액을 배출한 다음 주입합니다. 주사를 수행하는 사람은 한 손으로 마우스를 부드럽게 잡고 다른 손으로 바늘을 잡아야합니다. 두 번째 사람은 플런저를 천천히 밀어야 합니다.
- 주사기를 천천히 집어넣습니다. 눈가를 촉촉하게 유지하기 위해 아이 모이스처라이징 드롭을 바르십시오.
- 설치류가 열 패드 위의 케이지에서 회복하도록 하고 동물을 계속 모니터링하십시오. 강아지와 함께 일하는 경우 동물이 숨을 쉬고 자발적으로 움직일 수 있을 때까지 동물을 다른 경고 동물과 함께 우리로 되돌리지 마십시오. 성인과 함께 작업하는 경우 흉골 누움을 회복할 때까지 설치류를 다른 경고 동물과 함께 우리로 되돌리지 마십시오.
3. 망막 조직의 적출
참고: 형광 표지된 입자가 주입되지 않은 눈의 망막 조직은 유세포 분석을 위한 대조군으로 수집해야 합니다. 단일 망막을 사용하여 분석을 수행할 수 있지만 최상의 성능을 위해서는 두 개의 망막을 함께 풀링해야 합니다.
- 형광 표지된 입자의 유리체강내 주사 후 3시간 후에 망막 조직을 수집합니다.
메모: 입자 용액 주입 후 시간은 각 특정 실험에 대해 최적화될 수 있지만, 주입 후 3시간이 지나면 대부분의 망막층 전체에서 입자 흡수를 볼 수 있음을 발견했습니다(그림 1C-D).
- 경추 탈구로 생쥐를 희생시킵니다.
- 45o 각도의 미세한 집게를 사용하여 눈꺼풀을 부드럽게 눌러 안구를 모아 안구를 고정합니다. 집게를 안구 뒤에 놓고 당깁니다.
- 해부 현미경으로 망막을 해부합니다. Ca2+/Mg2+가 함유된 소량의 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 안구를 옮깁니다. 페트리 접시의 건조한 부분에서 극세 집게 끝으로 각막 가장자리의 안구를 천공합니다.
- 45o 각도의 미세한 집게를 사용하여 안구를 잡고 스프링 가위를 사용하여 각막 가장자리 둘레의 약 절반이 절단될 때까지 각막 가장자리 주위를 자릅니다.
- 45o 각도의 미세한 집게로 안구를 잡고 안구를 PBS로 가져옵니다. 두 번째 한 쌍의 미세한45o 각도 겸자로 각막과 공막을 찢습니다. 수정체와 망막이 그대로 나옵니다.
- 수정체와 망막을 분리합니다. 망막을 채취하여 Ca2+/Mg2+가 함유된 PBS 2ml가 들어 있는 5.4ml 폴리스티렌 시험관에 옮깁니다.
4. 단일 세포 현탁액 준비
- 제조업체의 지침을 약간 수정한 신경 조직 해리 키트를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 간단히 말해서, P1000 피펫으로 위아래로 피펫팅하고 흔들림 없이 37°C에서 효소 분해를 수행하여 망막을 삼중화합니다.
5. 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액 염색
- 200μl의 염색 완충액(0.2% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.09% 아지드화나트륨을 함유한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수)에 세포를 재현탁하고 U-bottom 96-well plate로 옮깁니다. 130 x g에서 5분 동안 원심분리기.
메모: 아지드화나트륨은 인간과 환경에 해롭습니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 현지 규정에 따라 폐기물을 버리십시오.
- 싱크대 위에 플레이트를 뒤집어 상층액을 버리십시오. Fc 수용체를 차단하려면 웰당 5μg/ml의 항마우스 CD16/CD32 항체를 포함하는 25μl의 염색 완충액에 세포를 재현탁합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 0.5μg/ml의 안티 마우스 Ly6C-APC-Cy7, 0.5μg/ml의 안티 마우스 Ly6G-Pe-Cy7 및 2.5μg/ml의 안티 마우스 CD11b-BV650이 포함된 25μl의 염색 버퍼를 추가합니다.어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 130 x g에서 5분 동안 원심분리기를 가열합니다.플레이트를 뒤집어 상층액을 버립니다. 200 μl의 염색 완충액에 세포를 재현탁하여 세척합니다.
- 130 x g에서 5분 동안 원심분리기. 0.5μg/ml의 프로피듐 요오드화물(PI)을 함유한 200μl의 염색 완충액에 재현탁합니다. 1.2ml 마이크로타이터 튜브로 옮깁니다.
- 0.5μg/ml의 PI를 함유한 추가 100μl의 염색 완충액으로 웰을 세척하고 1.2ml 마이크로타이터 튜브에 이전 200μl로 풀링합니다. 총 부피 300μl의 염색된 세포를 얻을 수 있습니다.
6. 유세포 분석
- 기존의 3가지 레이저(보라색, 청색 및 적색 레이저)를 사용하는 경우 매우 밝은 형광 AF488 입자로 인한 상당한 파급으로 인해 PE, PerCP-Cy5.5, BV510 및 PI 염료를 사용하지 마십시오. PE 표지 항체 및 PI(PerCP-Cy5.5 채널 대신 mCherry 채널)를 사용할 수 있으므로 네 번째(노란색) 레이저를 사용하여 이 분석을 최적화합니다(그림 2).
메모: 노란색 레이저를 사용할 수 없는 경우 다른 채널에서 데드 셀 배제 염료를 사용하십시오.
- 죽은 세포를 제외하기 위한 PI 음성 세포(PI-)의 게이트(그림 2B).
- 죽은 세포를 제외한 후 CD11b 양성 세포(CD11b+)를 게이트하면 모든 골수성 세포가 포함됩니다(그림 2C).
- CD11b+ 집단 내에서 Ly6C-/Ly6G-를 게이트하여 호중구(CD11b+/Ly6G+) 및 단핵구(CD11b+/Ly6C+; 그림 2D). 미세아교세포(여기서는 편의상 CD11b+/Ly6C-/Ly6G-로 정의됨)에 대한 게이팅 후 두 개의 명확한 개체군을 볼 수 있어야 합니다. 하나는 형광 표지된 입자에 대해 음성이고 다른 하나는 양성입니다. 식세포 세포는 입자를 흡수하므로 AF488+입니다(그림 2E).
메모: 이 염색 접근법을 사용하여 입자 흡수를 측정하기 위해 Ly6C 양성 또는 Ly6G 양성 집단을 분석할 수도 있습니다. 식세포 CD11b+ 세포의 비율은 식세포 미세아교세포의 비율과 상관관계가 높습니다(그림 2F). 유세포 분석 경험이 없는 연구자의 경우, CD11b 염색만으로도 간단한 분석을 수행할 수 있지만, 여기에는 식세포 호중구 및 단핵구, 미세아교세포가 포함됩니다. 이 CD11b+/Ly6C-/Ly6G- 집단 내에서 이 세포는 마커 F4/80 및 CX3CR1로 염색하여 판단한 바와 같이 99% 미세아교세포> 분포되어 있습니다. 이러한 마커는 추가할 수 있지만 우리 손에 반드시 필요한 것은 아닙니다.
