$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: 이 프로토콜은 신선하거나 냉동된 분리된 말초 혈액 세포 및 전혈에 대해 테스트되었습니다.
1. 세포 염색
참고: 스펙트럼 중복이 거의 없는 형광 색소 쌍을 선택하는 것은 다른 형광 검출기에서 형광 색소의 높은 파급으로 인한 데이터 확산을 줄이는 데 중요합니다. 모든 세포 subset을 최적으로 식별하려면 항체 쌍 PE-BV421 및 PE-APC와 같은 양자 수율이 높은 형광 색소를 사용해야 합니다.
- 신선 및 냉동 PBMC의 염색
- 100μL의 PBMC(1 x 106셀)를 96웰 V-바닥 플레이트로 옮깁니다.
메모: 1 x 106보다 작은 셀을 여러 개 사용해도 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다.
- 350 x g에서 상온에서 3분 동안 원심분리기를 하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 각 웰에 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 이 염료는 단백질의 유리 아민과 10분 동안 반응하여 죽은 세포를 라벨링합니다.
- 각 샘플에 대해 모든 항체(형광 색소 A의 항-CD3. -CD56, TCRγδ 및 형광 색소 B의 항-CD4, CD8, CD19, CD14)를 포함하는 혼합물을 준비합니다. 항체의 농도는 표 1 및 표 2에 표시되어 있습니다. 이 단계에서, 다른 표적 분자 및 다른 형광 색소에 대한 적정 항체도 추가할 수 있습니다(예: 표 3).
메모: 항체 농도는 제조업체와 로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 최적의 신호를 얻기 위해 예비 테스트를 수행해야 합니다. PBS, PBS/0.5% 소 혈청 알부민(BSA), PBS/0.2% 아지드화나트륨 또는 PBS/0.5% BSA/0.1% 아지드화나트륨을 사용하여 묽은 항체와 유사한 결과를 얻었습니다. 또한 30 μL와 다른 부피로 세포를 염색할 수 있어 이 방법을 기존 염색 프로토콜에 쉽게 통합할 수 있습니다.
- 350 x g에서 상온에서 3분 동안 원심분리기를 하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 각 웰에 항체 칵테일을 추가하고 기포가 생성되지 않도록 조심스럽게 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
메모: 4°C에서 유사한 결과로 샘플을 염색할 수 있습니다.
- 150μL의 염색 완충액과 원심분리를 350 x g에서 RT에서 3분 동안 추가하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 200 μL의 PBS에 세포를 재현탁하고 유세포 분석기에서 데이터를 획득합니다. 염색량이 변경되는 경우 초과 항체를 세척하는 데 사용된 원래 항체 혼합물을 최소 20배 희석하십시오.
메모: 염색된 세포는 PBS/2% 파라포름알데히드 내에 고정하고 4°C의 냉장고에서 하룻밤 동안 보관한 다음 다음 날 유세포 분석기에서 획득할 수 있습니다.
주의: 파라포름알데히드는 삼키면 해롭고 피부 자극을 유발할 수 있습니다.
2. 항체 적정
참고: 항체 적정은 고품질의 재현 가능한 데이터를 얻기 위한 가장 중요한 단계입니다. anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 및 -TCR γδ의 적정은 양성 및 음성 피크를 최적으로 분리하기 위한 항체 농도가 최대 염색 지수에 의해 도출되는 표준 절차를 따릅니다. 염색 지수 곡선의 상승 측에서 피크 또는 피크에 더 가까운 희석을 선택해야 합니다(그림 1A-C). 항-CD4 항체는 CD3 단일 양성 집단과 CD3+/CD8+ T 세포 사이에 CD4 양성 집단의 피크를 배치하도록 적정하여 CD8dim 집단(CD8+ γδ T 세포 및 NK T 세포)을 더 잘 구별하기 위해 CD3 단일 양성 신호에 더 가깝습니다. 같은 맥락에서 CD56 적정은 CD3+와 CD3- 집단 사이에 NK CD56+ 세포를 배치하는 것을 목표로 합니다.
- 최대 얼룩 지수 곡선
참고: anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 및 -TCR γδ의 적정은 양성 및 음성 피크를 최적으로 분리하기 위한 항체 농도가 최대 염색 지수 곡선에 의해 도출되는 표준 절차를 따릅니다. 다른 마커에 대한 항체가 패널에 추가되는 경우, 최대 염색 지수 곡선으로 적정해야 합니다.
- 96웰 플레이트의 10웰에 40μL의 염색 완충액을 채워 2배 항체 희석을 준비합니다. 첫 번째 웰에서 최종 부피를 80μL의 염색 완충액으로 늘리고 제조업체가 제안한 농도의 4배의 농도로 관심 항체를 추가합니다.
- 잘 섞고 40μL를 두 번째 웰로 옮깁니다. 잘 섞고 다른 모든 웰에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 앞서 설명한 프로토콜에 따라 PBMC 또는 전혈 샘플 10개를 10가지 2배 희석 항체 중 30μL로 염색합니다.
- 유세포 분석기로 데이터를 수집하고 각 희석액의 신호를 플롯합니다(그림 1A).
- 각 항체 농도에 대한 음성 및 양성 모집단에 대한 게이트. 항체의 농도를 높이면 더 높은 배경으로 이어질 수 있습니다. 따라서 그에 따라 음수 게이트의 크기를 조정하십시오.
- 각 항체 농도에 대해 음성 모집단의 형광 강도에 대한 중앙값 및 표준 편차에 대한 정보와 양성 모집단의 형광 강도에 대한 중앙값에 대한 정보를 추출합니다. 각 항체 농도에 대해 다음 공식을 사용하여 염색 지수를 계산합니다: (양성 인구의 형광 강도 중앙값 - 음성 인구의 형광 강도 중앙값) ÷ (음성 인구의 형광 강도의 표준 편차의 2 x 표준 편차) (그림 1B).
- 항체 희석의 분수로 표현된 항체 농도 대 염색 지수를 플롯하고(예: 1:10 희석 = 0.1), 최대 염색 지수 값으로 항체 농도를 식별합니다(그림 1C).
- 항-CD4 및 -CD56 항체 적정
참고: Anti-CD4 및 -CD56 항체 적정은 2-형광 패널에 있는 다른 마커의 이전 적정에 의존합니다. 항-CD4 항체의 경우, 적정은 이중 CD8+/CD3+ 신호와 CD3 단일 양성 집단 사이에 항-CD4 신호를 배치하는 것을 목표로 합니다(그림 1D).
- 앞서 설명한 바와 같이 2배 희석 전략으로 항-CD4 및 CD56 항체를 적정하고, 그 사이에 추가 농도를 추가하여 다른 세포 집단에서 CD4+ T 세포와 NK 세포를 분리할 수 있는 농도 범위를 미세하게 식별합니다.
- 이중 CD8+/CD3+ 신호와 CD3 단일 양성 모집단 사이에 anti-CD4 신호를 배치하여 anti-CD4 항체를 적정합니다(그림 1D).
메모: CD8+ dim 집단에서 CD4+ T 세포를 명확하게 분리하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다.
- CD3 음성 집단과 CD3 양성 집단 사이에 NK 세포를 배치하여 항-CD4 항체 적정과 유사한 전략에 따라 항-CD56 항체를 적정합니다.
3. 게이팅 전략
- 림프구 및 단핵구 세포 집단을 식별하고 분석에서 죽은 세포와 대부분의 잔류 적혈구를 제거합니다.
- 전방 대 측면 산란 영역(FSC-A 대 SSC-A)을 기준으로 림프구와 단핵구를 포함하는 전체 모집단을 선택합니다. 전방 산란 높이 대 전방 산란 폭(FSC-H 대 FSC-W) 및 측면 산란 높이 대 측면 산란 너비(SSC-H 대 SSC-W)를 통해 분석에서 셀 응집체를 제거합니다.
- live/dead 변별을 사용하여 밝은 양성 사체 세포와 잔류 적혈구를 분석에서 제외합니다. 서로 다른 FSC-A 및 SSC-A 프로파일을 기반으로 한 림프구 및 단핵구에 대한 게이트.
- 림프구 집단의 2-형광 7-마커 게이팅 전략.
메모: CD3 양성 하위 그룹 내에서 CD4+, CD8+ 및 γδ T 세포는 CD4, CD8 및 γδ 수용체만을 표적으로 하는 항체를 사용하여 분리할 수 있습니다. 이와 유사한 방식으로, CD3 음성 하위 그룹 내에서 B 세포, NK 세포 및 단핵구는 각각 CD19, CD56 및 CD14에 대한 항체를 사용하여 고유하게 식별될 수 있습니다.
- 림프구 게이트를 선택하고 이 프로토콜에 사용된 두 개의 형광 색소 중 하나를 각 축에 포함하는 점도표를 생성합니다(그림 2B).
- 점도표의 오른쪽 상단 모서리에서 CD3+/CD8+ 이중 양성 세포로 식별된 CD8+ T 세포의 게이트(그림 2B). NKT 세포를 포함할 수 있는 dim CD8 집단을 제외합니다. CD8+ T 세포와 CD3 단일 양성 집단 사이의 집단으로 확인된 CD4+ T 세포에 대한 게이트. 높은 CD3 세포로 확인된 γδ T 세포의 게이트. γδ T 세포를 CD8 양성 및 CD8 음성으로 세분화합니다.
- CD3 양성 세포와 CD3 음성 세포 사이의 집단으로 확인된 NK 세포에 대한 게이트. NK 세포를 CD8 양성 및 CD8 음성으로 세분화합니다. 점도표의 오른쪽 하단 모서리에 있는 CD3 음성 CD19+ 집단으로 식별된 B 세포에 대한 게이트.
- 단핵구 게이트를 선택하고 이 프로토콜에 사용된 두 개의 형광 색소 중 하나가 각 축에 있는 점도표를 생성합니다(그림 2C). CD3-/CD14+ 모집단에 대한 게이트.
표 1: PBMC(BV421-PE 조합)의 2-형광 색소 면역 세포 염색에 사용되는 항체 패널.
년
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층
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시리즈
년
시리즈
년
년
| 과녁 | 클론 | 형광 색소 | 점원 | 농도 | 목적 |
| CD3 | 우흐트1 | BV421 | BD (영어) | 1/20 | 혈통 |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD (영어) | 1/900 | |
| TCRγδ | 지하 1 | BV421 | 바이오 | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | 체육 | BD (영어) | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | 체육 | BD (영어) | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | 체육 | BD (영어) | 1/15 | |
| CD19 | 힙19 | 체육 | BD (영어) | 1/300 | |
| 죽은 세포 | | L/D 블루 | LT | 1/300 | 생사(Live/Dead)의 차별 |
| BD = BD 생명과학, 바이오 = BioLegend, LT = 생명 기술 |
표 2: PBMC의 2-형광 면역 세포 염색에 사용되는 항체 패널(APC-PE 조합).
년
년
층
년
시리즈
년
시리즈
년
년
| 과녁 | 클론 | 형광 색소 | 점원 | 농도 | 목적 |
| CD3 | 우흐트1 | APC (에이피씨) | BD (영어) | 1/20 | 혈통 |
| CD56 | NCAM16.2 | APC (에이피씨) | BD (영어) | 1/60 | |
| TCRγδ | 지하 1 | APC (에이피씨) | 바이오 | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | 체육 | BD (영어) | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | 체육 | BD (영어) | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | 체육 | BD (영어) | 1/15 | |
| CD19 | 힙19 | 체육 | BD (영어) | 1/300 | |
| 죽은 세포 | | L/D 블루 | LT | 1/300 | 생사(Live/Dead)의 차별 |
| BD = BD 생명과학, 바이오 = BioLegend, LT = 생명 기술 |
표 3: 다발성 골수종 환자의 동결된 PBMC를 염색하는 데 사용되는 항체 패널.
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시리즈
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시리즈
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시리즈
년
시리즈
년
년
년
년
년
(영어)
년
년
| 과녁 | 클론 | 형광 색소 | 카탈로그 | 점원 | 농도 | 목적 |
| CD3 | 우흐트1 | BV421 | 562426 | BD (영어) | 1/20 | 혈통 |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD (영어) | 1/900 | |
| TCRγδ | 지하 1 | BV421 | 331217 | 바이오 | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | 체육 | 555347 | BD (영어) | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | 체육 | 555367 | BD (영어) | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | 체육 | 555398 | BD (영어) | 1/15 | |
| CD19 | 힙19 | 체육 | 555413 | BD (영어) | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | 바이오 | 1/30 | 분화 |
| CD45RA | 하이100 | APC-H7 | 560674 | BD (영어) | 1/60 | |
| CCR4 | 1G1 | PE-Cy7 | 561034 | BD (영어) | 1/60 | Th 부분 집합 |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | 바이오 | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD (영어) | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | BD (영어) | 1/900 | 활성화/소진 |
| HLA-DR | 사46-6 | BV510 | 563083 | BD (영어) | 1/30 | |
| CD16 | 3G8 | 부브395 | 563784 | BD (영어) | 1/30 | NK, 단핵구 활성화 |
| 죽은 세포 | L/D 블루 | L-23105 | LT | 1/300 | 생사(Live/Dead)의 차별 |
