면역 세포의 표현형 및 기능적 특성화를 위한 바코드 분석

Abstract

출처: Baxter, R. M., et al. 질량 세포 분석을 통한 말초 전혈의 면역 표현형 및 사이토카인 생산의 단일 세포 분석. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 별개의 세포 바코드를 위해 중금속 접합 항체를 사용하는 단일 세포 단백질체학 방법을 강조합니다. 그 후, 면역염색 및 질량 세포 분석법(mass cytometry)을 적용하여 인간 전혈 유래 면역 세포의 면역 표현형 및 기능적 변화를 평가합니다.

Protocol

1. 용해/고정 혈액 세포의 바코드

1. -80 °C 저장소에서 용해/고정 세포 샘플을 얼음 위에서 천천히 해동하십시오. 최대 20개의 샘플에 고유한 바코드를 표시하고 이 시스템을 사용하여 풀링할 수 있습니다. PBS로 10X 바코드 펌 버퍼를 1:10으로 희석합니다. 샘플당 ~3mL를 위한 충분한 버퍼를 만드십시오.
2. 비멸균 트러프 하나는 CSM으로, 다른 하나는 1X 바코드 펌 버퍼로 채웁니다. 갓 해동한 샘플에 얼음처럼 차가운 CSM 1mL를 첨가하고 피펫으로 완전히 혼합한 다음 사전 라벨링된 각각의 폴리프로필렌 클러스터 튜브로 옮깁니다.
3. 10μL 샘플을 채취하여 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 각 클러스터 튜브에서 세포 수를 샘플당 1.5–2 x 10⁶ 세포로 정규화: 2 x 10⁶ 세포 이상의 과도한 세포 부피를 제거하고 폐기합니다.
4. 실온에서 600 x g에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 멀티채널 피펫과 원심분리기를 사용하여 1mL의 1X 바코드 펌 버퍼에 실온에서 5분 동안 600 x g의 세포를 재현탁합니다. 상층액을 흡입하십시오.
5. 바코드 키에 표시된 것과 동일한 순서로 클러스터 튜브를 랙에 정렬하여 샘플이 바코드와 일치하도록 합니다. 세포 손실을 줄이기 위해 피펫 팁(혼합 없음)으로 세포 펠릿을 건드리지 않고 클러스터 튜브의 모든 샘플에 멀티채널 피펫으로 800 μL 1X 바코드 펌 버퍼를 추가합니다. 클러스터 튜브가 있는 랙을 따로 보관하십시오.
6. -20°C에서 20-plex Pd 바코드 키트 튜브 스트립을 제거하고 실온에서 해동합니다. 100μL의 1X 바코드 펌 버퍼를 추가하고, 철저히 혼합한 다음, 120μL의 재현탁 바코드 혼합물을 클러스터 튜브의 해당 세포 샘플로 옮깁니다.
7. 멀티채널 피펫으로 철저히 혼합하여 개별적으로 바코드화된 시료 사이에 교차 오염이 발생하지 않도록 합니다. 바코드가 세포에 라벨을 붙일 수 있도록 실온에서 30분 동안 클러스터 튜브를 배양합니다.
8. 실온에서 600 x g에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 흡입한 다음 CSM 1mL에 재현탁합니다.
9. CSM에서 원심분리기 및 다시 부유합니다.
   메모: 이제 각 샘플에는 고유한 바코드가 부착되어 있으며 샘플을 통합할 준비가 되었습니다.
10. 실온에서 600 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다. 단일 피펫과 동일한 팁을 사용하여 ~70–80 μL 잔류 부피의 모든 세포 펠릿을 하나의 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 피펫 팁을 배출하지 마십시오. 이 팁으로 단일 피펫을 따로 보관하십시오.
11. 멀티채널 피펫과 새로운 팁을 사용하여 각 기존 클러스터 튜브에 ~100 μL CSM을 추가하여 세포 회수를 극대화할 수 있습니다. 팁이 있는 단일 피펫을 사용하여 ~100μL 잔류 부피의 모든 세포 펠릿을 동일한 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.
12. CSM을 추가하여 폴리스티렌 튜브(~3mL)를 마무리합니다. 풀링된 바코드 세트의 셀 번호를 세고 기록합니다. 실온에서 600 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다. 같은 날에 바코드가 있는 샘플의 염색을 진행하십시오.
    참고: 바코드 프로세스에서 ~20–30%의 셀 손실이 예상되는 것은 정상입니다.

2. 바코드 용해/고정 혈액 세포의 염색 및 질량 세포 분석 기기 분석 준비

참고: 염색 항체의 각 1X 역가(100μL 염색 반응당 항체 1μL)는 일반적으로 3-4 x 10⁶ 세포를 염색할 수 있습니다. 따라서 바코드가 찍힌 모든 시료를 하나의 튜브에 모을 때 항체의 양을 확장해야 합니다. 20개의 바코드 샘플이 30 x 10⁶ 셀에 해당하고 각 1X titer가 3–4 x 10⁶ 셀을 염색할 수 있는 경우, 바코드 샘플에는 각 샘플을 개별적으로 염색하는 것과 달리 10X titer만 필요하며, 이를 위해서는 20배의 항체(개별 튜브당 1X)가 필요합니다. 세포 수에 대한 항체의 농도는 각 개별 항체 칵테일에 대해 신중하게 적정해야 합니다(여기서는 논의되지 않음).

1. 표면 염색 및 사이토카인 유도를 위한 항체(Table of Materials)를 사용하여 세포를 염색합니다.
   1. 첨가할 양을 계산하고 파이펫팅 오류를 고려하여 표면 염색 칵테일을 만듭니다(즉, 각 샘플에서 2 x 10⁶ 셀의 바코드 샘플 20개를 염색하는 경우 10X titer 염색이 필요합니다. 최종 부피 계산을 위해 10.5X 최종 염색 용액을 만들어 파이펫팅 오류를 보상
   ).
   2. 바코드가 부착된 세포 펠릿에 10배 상당의 표면 염색 부피를 추가합니다. 세포 손실을 줄이려면 동일한 팁으로 표면 염색과 세포 펠릿의 부피를 혼합하고 측정합니다.
   3. 세포의 부피와 염색 칵테일에 따라 세포 샘플 수당 50μL의 최종 염색 부피에 CSM을 추가합니다(즉, 20개의 샘플 세트를 실행하는 경우 50μL X 20 = 1mL). 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 균일한 염색을 촉진하기 위해 15분마다 샘플을 교반합니다.
   4. 표면 염색 배양 중 여과된 ddH₂O로 1:10을 희석하여 Perm/Wash 완충액(Table of Materials)을 준비합니다. 투과화를 위해 2mL, 세척을 위해 5mL를 준비합니다. 4 °C 또는 얼음 위에 보관하십시오.
   5. CSM으로 표면 염색 튜브를 마무리하고 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입합니다. 바코드가 있는 샘플을 2mL의 4°C, 1:10 희석 Perm/Wash 버퍼에 재현탁합니다. 세포가 완전히 투과될 때까지 4°C에서 20-30분 동안 배양합니다.
   6. 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다.
   7. 세포 내 염색의 경우 유사한 염색 단계를 따릅니다(표면 염색과 마찬가지로). 그러나 CSM 대신 4 °C, 1:10 희석 Perm/Wash 완충액을 사용하여 총 염색량을 측정하여 세포 내 염색 전반에 걸쳐 세포가 투과성 환경에 유지되도록 합니다.
   8. 염색 및 투과화된 세포 펠릿 표면에 세포 내 항체 칵테일을 추가합니다(단계 2.1.2–2.1.7). 총 염색량을 세포 샘플 수당 50 μL로 가져옵니다. 4 °C에서 60분 동안 배양합니다. 균일한 염색을 위해 15분마다 샘플을 교반합니다.
   9. 세포 내 염색 중에 인터컬레이터 용액을 준비합니다: 여과된 PBS 900μL + 여과된 16% PFA 100μL(최종 농도 1.6% PFA) + 500uM 인터칼레이터 염료 0.2μL(재료 표).
   10. 세포 펠릿 + 세포 내 항체 칵테일을 차가운 1:10 Perm/Wash 버퍼로 마무리합니다.
   11. 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다. 염색 튜브를 CSM으로 마무리합니다. 셀 번호를 세고 기록합니다. 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다. 단계 4.9의 인터칼레이터 용액 1mL에 세포를 재현탁합니다. 전체 삽입을 위해 실온에서 최소 20분 동안 배양하거나 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다(삽입기 용액의 샘플은 질량 세포 분석 기기에서 실행하기 전에 최대 1주일 동안 4°C를 유지할 수 있음).
2. 질량 세포 분석 기기를 위한 세포를 준비합니다.
   1. 여과된 ddH₂O 3mL로 튜브를 덮고 4°C에서 5분 동안 600 x g에서 원심분리합니다. 여과된 ddH₂O 3mL에 세포를 재현탁합니다. 이 현탁액을 100μm 필터에 통과시켜 질량 세포 분석 기기를 막을 수 있는 파편이나 응집체를 제거합니다.
   2. 여과 후 세포 수를 세고 기록합니다. 600 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기
3. 검량 비드 용액(Table of Materials)을 여과된 ddH₂O에 1:10으로 희석하여 준비합니다.
4. 염색된 세포를 필요한 부피의 1:10 희석된 검량식 비드 용액에 재현탁시켜 ~1 x 10⁶ cells.
   의 세포 농도를 달성합니다. 메모: 45 μL/min에서 CyTOF1의 경우 권장되는 최적점은 5 x 10⁵ cells/mL입니다. Helios의 경우 30μL/분, 7.5 x 10⁵셀/mL.
5. 질량 세포 분석 기기에서 샘플을 실행합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
룩소리티닙	산타 크루즈	사우스 캐롤라이나-364729A	재고 Conc : 10 mM; 최종 농도 : 5 μM
R848	인비보젠	TLRL-R848-5	재고 계수: 1 μg/μL; 최종 농도 : 1 μg / mL
LPS-EK	인비보젠	TLRL-EKLPS	재고 계수: 1 μg/μL; 최종 농도 : 0.1 μg / mL
멸균 PBS	론자	17-516층
Lyse/Fix 버퍼	BD 생명과학	558049	주식 콩그레스: 5X; 최종 Conc : 1X (ddH2O에 희석)
BD Phosflow 펌/워시 버퍼 I	BD 생명과학	557885	주식 콘크: 10배; 최종 Conc: 1:10 (ddH2O에 희석)
RPMI	지브코	21870-076
아지드화나트륨(NaN3)	시그마-알드리치	S-8032	주식 conc:>99.9%; 최종 계수: 0.0002
단백질 수송 억제제(PTI)	e바이오사이언스	전화: 00-4980-93	주식 콘크리트: 500X; 파이널 콘크리트: 1X
DNA 인터컬레이터	플루이다임	201192ᄂ	증권 Conc: 500 μM; 최종 농도 : 0.1 μM
MaxPar 바코드 펌 버퍼	플루이다임	201057	주식 콘크: 10배; 파이널 콘크리트: 1X
20-plex Pd 바코드 세트	플루이다임	S0014	주식 Conc: n/a; 최종 Conc: 해당 없음
질량 세포 분석에 사용되는 항체
표면 마커
CD1c	바이오레전드	L161	질량 : 161
CD3	BD (영어)	우흐트1	질량 : 144
CD4	바이오레전드	SK3	질량 : 174
CD7 (영어	BD (영어)	M-T701	질량 : 149
CD8	바이오레전드	SK1	질량: 142
CD11b	플루이다임	ICRF44	질량 : 209
CD11c	BD (영어)	비-리6	질량 : 152
CD15	BD (영어)	하이98	질량 : 115
CD14	바이오레전드	M5E2	질량 : 154
CD16	eBioscience/써모	나73.1	질량: 165
CD19	산타 크루즈	SJ25C1	질량 : 163
CD21	바이오레전드	부32	질량 : 141
CD27	BD (영어)	L128	질량 : 155
CD38	플루이다임	히트2	질량 : 172
CD45 합계	바이오레전드	하이30	질량 : 89
CD45RA	바이오레전드	하이100	질량 : 153
CD56	밀테니	REA196	질량 : 168
CD66	BD (영어)	B1.1/CD66	질량: 113
CD86	플루이다임	IT2.2	질량 : 150
CD123	플루이다임	6시간 6	질량: 143
CD278/아이코스	바이오레전드	씨398.4ᅡ	질량 : 156
CD179/PD1	바이오레전드	EH12.2H7	질량 : 162
IgD (영어)	바이오레전드	IA6-2	질량 : 146
이그엠	바이오레전드	MHM-88	질량 : 151
CXCR5	BD (영어)	RF8B2	질량 : 173
흘라드르	바이오레전드	L243	질량 : 167
사이토카인
IL-1α	바이오레전드	364-3B3-14	질량 : 147
IL-1β	바이오레전드	H1B-98	질량 : 169
IL-1RA	산타 크루즈	AS17 (영문	질량 : 157
일리노이 -6	바이오레전드	MQ2-13A5	질량 : 164
일리노이 -8	BD (영어)	E8N1	질량 : 160
IL-12/IL-23P40	바이오레전드	C8.6	질량 : 171
IL-17A	바이오레전드	BL168	질량 : 148
IL23p19	eBioscience/써모	23DCDP	질량 : 176
밉1β	BD (영어)	D21-1351	질량 : 158
MCP1	BD (영어)	5D3-F7	질량: 170
IFNα	밀테니	실27:295	질량 : 175
IFNγ	바이오레전드	4S.B3	질량: 165
PTEN	BD (영어)	A2B1	질량 : 159
티엔에프α	바이오레전드	마브11	질량 : 166
참고: 제조업체가 Fluidigm으로 명시된 경우 이 항체는 금속이 사전 접합된 상태로 Fluidigm에서 구입했습니다. 제조업체가 Fluidigm 이외의 것으로 명시되어 있는 경우, 이 항체는 제조업체 프로토콜에 따라 MaxPar Multi-Metal Labeling Kit(Fluidigm Cat: 201300)를 사용하여 자가 접합되었습니다.