DNA 기반 장력 프로브를 사용하여 면역 세포가 가하는 수용체 힘 평가

초록

출처: Ma, R. et al., DNA Tension Probes to Map the transient Piconewton receptor forces by immune cells. J. Vis. 특급.(2021년)

이 비디오는 폴리에틸렌 글리콜 고정 금 나노 입자와 DNA 헤어핀 장력 프로브를 사용하여 면역 세포가 가하는 수용체를 평가하는 방법을 보여줍니다. CD8 양성 T 세포 상호 작용은 프로브 풀림을 트리거하여 형광을 방출하는 반면 잠금 가닥은 면역 세포가 가하는 힘을 정량화하기 위한 신호를 유지합니다.

프로토콜

1. 올리고뉴클레오티드 제제

1. 리간드 가닥 디옥시리보 핵산(DNA)을 물(18.2MΩ 저항률, 전체 프로토콜에 사용됨)에 용해시킵니다. Vortex를 사용하여 탁상용 원심 분리기로 용액을 회전시킵니다. 최종 농도가 1mM가 되도록 물의 양을 조정합니다. 나노드롭 분광 광도계를 사용하여 260nm에서 흡광도를 측정하고 올리고뉴클레오티드의 흡광 계수를 기반으로 최종 농도를 측정하여 농도를 검증합니다.
   메모: 리간드 가닥은 각 말단, 5' 아민 및 3' 비오틴에서 변형을 가하여 형광단과 접합하고 비오틴화된 리간드를 제시합니다. 리간드 가닥의 아민기는 형광단과 결합되어야 합니다. Cy3B 염료는 높은 밝기와 광안정성으로 인해 이러한 접합에 사용되지만 일반적으로 상업적으로 제공되지 않으며 사내 접합이 필요합니다. 따라서 다음 섹션에서는 아민과 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 염료 간의 접합에 대해 설명합니다. 핵산 변형을 위한 시설이나 자원에 액세스할 수 없는 최종 사용자의 경우, Alexa 및 Atto 염료 계열과 같은 밝고 광안정성 염료를 제공하는 맞춤형 DNA 합성 공급업체에서 변형된 핵산을 구입할 수 있습니다.
2. 10x 인산염 완충 식염수(PBS) 및 1M 중탄산나트륨(NaHCO₃) 용액을 준비합니다. 10 μL의 1 mM 아민 리간드 가닥 용액 (10 nmol)을 10 μL의 10x PBS, 1 M NaHCO₃ 10 μL 및 H₂O 60 μL와 혼합합니다. 사용 직전에 50 μg의 Cy3B N-하이드록시숙신이미드(NHS 에스테르)를 10 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고 혼합물에 첨가하여 총 반응 부피를 100 μL로 합니다. Cy3B NHS 에스테르를 첨가합니다. 지난. 실온에서 하룻밤 동안 1시간 또는 4°C에서 반응시킵니다.
3. 아민 잠금 가닥을 Atto647N NHS 에스테르와 접합하여 Atto647N 잠금 가닥을 준비합니다. 10x PBS 및 1M NaHCO₃ 용액을 준비합니다. 10 μL의 1 mM 아민 잠금 스트랜드 용액 (10 nmol)을 10 μL의 10x PBS, 10 μL의 1 M NaHCO₃ 및 60 μL의 H₂O와 혼합합니다. 사용 직전에 50 μg의 Atto647N NHS 에스테르를 10 μL의 DMSO에 용해시키고 혼합물에 첨가하여 총 반응 부피 100 μL를 만듭니다. 마지막으로 Atto647N NHS 에스테르를 첨가합니다. 실온에서 하룻밤 동안 1시간 또는 4°C에서 반응시킵니다.
4. 반응 후에, P2 탈염 젤 여과에 의하여 부산물, 과잉 염료 및 소금을 제거하십시오. _H2O와의 반응 혼합물을 총 부피 300μL로 희석하며, 이는 후속 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography) 정제 단계에 적합합니다. 650μL의 수화 P2 겔을 원심 장치에 추가하고 18,000 x g에서 1분 동안 스핀다운합니다. 장치 바닥에서 액체를 제거하고 P2 겔이 포함된 컬럼에 반응 혼합물을 추가하고 1분 동안 18,000 x g에서 스핀다운하고 장치 바닥에서 반응 혼합물을 수집합니다.
   메모: P2 젤은 H₂O와 함께 사용하기 최소 4 시간 전에 수분을 공급해야합니다.
5. 올리고뉴클레오티드 정제를 위해 지정된 C18 컬럼을 사용하여_H2O 및 B: 아세토니트릴(ACN)의 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA)를 0.5mL/분의 유속으로 50분 동안 선형 그래디언트 용출 10-100% B를 위한 이동상으로 사용하여 탈염된 반응 혼합물을 HPLC로 정제합니다. 정제를 위해 500μL 주입 루프를 사용하여 역상 HPLC에 탈염 반응 혼합물을 주입합니다. 디옥시리보핵산, DNA(260nm)에 대한 흡광도 피크, 형광단에 대한 흡광도 피크(Cy3B의 경우 560nm, Atto647N의 경우 647nm)를 수집하여 진공 원심 농축기에서 밤새 건조시킵니다(그림 1A 참조).
6. 건조된 올리고 염료 생성물을 100μL의 물에 재구성합니다. 나노드롭 분광 광도계로 Cy3B 리간드 가닥과 Atto647N 잠금 가닥의 농도를 측정합니다. 염료 라벨링 비율이 1:1에 가까운지 확인합니다. 올리고뉴클레오티드 농도를 결정할 때 필요한 경우 염료의 260nm 흡광도를 수정합니다.
7. MALDI-TOF-MS 시료 전처리를 위해 1-5μM에서 0.5μL의 산물을 사용하여 3-하이드록시프로필데히드(3-HPA)를 50% ACN/H_2O와 0.1% 트리플루오아세트산(TFA) 및 5mg/mL 구연산암모늄의 기질로 사용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF-MS)으로 정제된 제품을 검증합니다. 질량 스펙트럼의 예는 그림 1B에서 찾을 수 있습니다.
8. 헤어핀 가닥과 담금질 앵커 가닥을 물에 녹이고 원액의 농도가 50 및 100 μM.
   사이인지 확인합니다. 메모: 헤어핀 스트랜드는 변형되지 않으며 공급업체에서 직접 맞춤 합성할 수 있습니다. 앵커 스트랜드에는 티올 앵커링 그룹과 담금질제 BHQ2가 있으며 공급업체에서 직접 맞춤 합성할 수 있습니다.
9. 모든 올리고뉴클레오티드를 분취합니다. 단기 사용 및 보관을 위해 이러한 올리고뉴클레오티드를 4°C에서 보관하십시오. 장기 보관을 위해 얼렸다가 -20 °C로 유지하십시오. 이 시점에서 모든 올리고뉴클레오티드는 DNA 장력 프로브 어셈블리를 사용할 준비가 되었습니다.
   메모: 반복되는 동결-해동 주기는 올리고뉴클레오티드에 문제가 되지 않습니다.

2. 표면 처리

참고: DNA 헤어핀 장력 프로브 기판의 준비는 이틀이 걸립니다. DNA 헤어핀 장력 프로브는 유리 커버슬립에 기능화될 것입니다.

1. 1일차
   1. 25mm 커버슬립을 50mL 비커의 폴리테트라플루오로에틸렌 랙에 놓습니다. 각 랙에는 최대 8개의 커버슬립을 수용할 수 있습니다. 커버슬립을 물에 세 번 담가 헹굽니다.
   2. 물과 혼합된 에탄올 1:1 비율(v:v) 용액 40mL를 랙과 커버슬립이 들어 있는 비커에 넣고 파라핀 필름을 사용하여 비커를 밀봉합니다.
   3. 초음파 세척기(작동 주파수 15KHz)에서 비커를 35분 동안 초음파 처리하여 커버슬립을 청소합니다. 초음파 처리 후 액체를 버리고 랙과 커버슬립으로 비커를 물로 6회 이상 헹구어 남아 있는 유기 용매를 제거합니다.
   4. 황산과 과산화수소를 3:1의 비율로 혼합하여 새로운 피라냐 용액을 준비합니다. 40mL의 피라냐 용액을 만들려면 먼저 깨끗한 50mL 비커에 황산 30mL를 넣은 다음 과산화수소 10mL, H₂O₂를 천천히 첨가합니다. Piranha 용액은 H₂O₂를 추가하면 빠르게 가열되고 거품이 일어납니다. 유리 피펫 끝을 사용하여 피라냐를 부드럽게 섞습니다.
   5. 다음으로, 커버슬립을 고정하는 랙을 에칭을 위해 부드럽게 혼합된 피라냐 용액이 들어 있는 비커로 옮깁니다(그림 2A). Piranha 용액이 하이드록실화되도록 하고 실온에서 30분 동안 커버슬립을 청소합니다. 피라냐 에칭 후 강철 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 핀셋을 사용하여 깨끗한 50mL 비커에 물을 넣고 최소 6회 물로 다시 헹굽니다.
      주의: 다량의 유기 물질이 피라냐 용액과 격렬하게 반응하여 폭발을 일으킬 수 있습니다. 조심하고 항상 흄 후드에서 Piranha 용액으로 작업하십시오. 반드시 실험복, 장갑, 보안경을 착용하세요. 새 피라냐 용액을 밀봉된 용기에 보관하지 마십시오.
      메모: 과산화수소 대 황산 비율은 1:2(v:v) 미만으로 유지되어야 하며 1:1을 초과해서는 안 됩니다. Piranha 용액에 커버슬립을 랙에 담글 때는 천천히 조심스럽게 용액에 넣으십시오. 용액은 여전히 활성이고 뜨거우므로 에칭 직후에 용액을 버리지 마십시오. 산성 폐기물 용기에 붓기 전에 비커에 밤새 그대로 두십시오.
   6. 커버 슬립을 고정하는 랙을 50mL 에탄올과 함께 40mL 비커에 담그어 물을 제거합니다. 에탄올을 버리고 물이 제거되었는지 확인하기 위해 3회 반복합니다.
   7. 그런 다음 랙을 40mL의 에탄올에 3% 아미노프로필 트리에톡시 실란(APTES)(v/v)에 담그고 실온에서 1시간 동안 커버슬립의 -OH와 반응합니다(그림 2B).
      메모: 에탄올은 아세톤으로 대체 될 수 있습니다.
   8. 표면을 40mL 에탄올에 담가 6회 헹군 다음 80°C의 오븐에서 20분 동안 건조합니다. 냉각 후 건조된 아민 변성 커버슬립을 -20°C에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다(최대 6개월).
   9. 직경 10cm 플라스틱 페트리 접시의 바닥 안쪽을 파라핀 필름으로 덮습니다. 파라핀 필름은 커버 슬립이 페트리 접시 내부로 미끄러지는 것을 방지하고 커버 슬립의 기능화의 다음 단계를 위한 솔루션을 유지하는 데 도움이 됩니다. 냉각된 아민 변형 커버슬립을 페트리 접시에 넣습니다. 기능화할 면이 위를 향해야 합니다.
   10. 커버슬립의 아민기를 수정하려면 0.1M NaHCO₃에 300μL의 0.5% w/v 리포산 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) NHS(LA-PEG-SC) 및 2.5% w/v mPEG NHS(mPEG-SC)를 각 커버슬립에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다(그림 2C). 각 25mm 커버슬립의 무게는 LA-PEG-SC 1.5mg, mPEG-SC 7.5mg입니다. NHS 시약은 실온의 수용액에서 반감기가 짧으므로 표면에 첨가하기 직전에 용해시킵니다. 반응 후 물로 표면을 3회 헹굽니다.
       메모: NHS 반응은 4°C에서 하룻밤 동안 수행할 수 있습니다. NHS 시약은 4°C에서 가수분해하기 전에 반감기가 더 길며, 이는 약 4-6시간입니다. 이로 인해 3일간의 표면 처리 절차가 진행됩니다.
   11. 100μL의 0.1M 중탄산나트륨, 1mg/mL를 함유한 NaHCO₃를 "샌드위치" 커버슬립 세트(사이에 반응 완충액이 있는 두 개의 커버슬립이 서로 마주보고 있음)에 추가합니다. 최소 30분 동안 패시베이션이 발생하도록 허용합니다. 시약을 절약하기 위해 이 단계는 50μL의 1mg/mL sulfo-NHS 아세테이트로 수행할 수 있습니다. 패시베이션 후 물로 세 번 헹굽니다.
   12. 각 커버슬립에 0.5mL의 금 나노 입자(AuNP, 8.8nm, 탄닌산, 0.05mg/mL)를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다(그림 2D). 시약을 절약하기 위해 이 단계는 두 개의 커버슬립을 끼워 수행할 수도 있습니다. 금 나노 입자의 응집을 피하기 위해 이전 단계의 시스템에 염이 없는지 확인하십시오. 이 단계 후에 커버슬립을 건조시킨 상태로 두지 마십시오.
   13. 한편, DNA 장력 프로브를 형성하는 4.7 pN 헤어핀, Cy3B 리간드 가닥 및 BHQ2 앵커 가닥은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 튜브에서 300nM에서 1M 염화나트륨(NaCl)에서 1.1:1:1의 비율로 구축됩니다. 용액을 최대 95°C까지 5분 동안 가열하여 가닥을 어닐링한 다음 열 순환기에서 30분 동안 온도를 20°C로 낮추어 점차적으로 냉각합니다.
   14. 금 나노 입자로 30분 배양 후 커버슬립을 물로 세 번 헹굽니다. 어닐링된 DNA 용액에 BHQ2 앵커 가닥(100μM 스톡에서)을 추가하여 BHQ2 앵커 가닥과 Cy3B 리간드 가닥 사이의 비율을 10:1로 만듭니다. 이 시점에서 DNA 용액에는 300nM의 장력 프로브 구조체와 2.7μM BHQ2 가닥이 포함되어야 합니다. 커버슬립 2개당 100μL를 추가하여 "샌드위치"를 만듭니다(그림 2E).
   15. 젖은 실험실 티슈 볼을 페트리 접시에 조심스럽게 넣고(커버슬립에서 멀리) 용액이 마르지 않도록 파라핀 필름으로 접시를 밀봉합니다. 접시를 호일로 덮고 4 ° C에서 밤새 배양합니다.
2. 2일차
   1. 1x PBS로 커버슬립에서 여분의 프로브를 씻어냅니다. 에피형광 현미경으로 DNA 장력 프로브 표면 품질을 확인합니다.
   2. 1x PBS에 40μg/mL의 스트렙타비딘을 준비하고 실온에서 30분 동안 커버슬립에서 배양합니다(그림 2F). 일반적으로 25mm 커버슬립에는 100μL로 충분합니다. 배양 후 PBS로 3회 헹구어 과도한 양의 스트렙타비딘을 씻어냅니다.
   3. 1x PBS에서 40μg/mL 비오틴화 항체/리간드를 준비합니다. 샌드위치당 50-100μL를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다(그림 2G). 배양 후 PBS로 3회 헹구어 과도한 양의 비오틴화 항체/리간드를 씻어냅니다.
   4. 깨끗한 이미징 챔버를 표면과 함께 조심스럽게 조립합니다. 챔버를 조일 때 표면에 쉽게 금이 갈 수 있습니다. 0.5-1mL의 Hank's balanced salt solution(HBSS)을 이미징 챔버에 추가하고 세포로 이미징할 수 있도록 준비합니다(그림 2H).

3. 이미징 세포 수용체 힘

1. HBSS에서 관심 면역 세포를 1-2 x 10⁶ cells.
   에서 준비합니다. 메모: 이 논문에서는 OT-1 CD8+ 나이브 세포를 예로 들었습니다. 제조업체의 지침에 따라 MACS(magnetic-activated cell sorting) 분리기가 있는 MACS 마우스 CD8⁺ T 세포 분리 키트를 사용하여 희생된 마우스의 비장에서 OT-1 CD8⁺ naive T 세포를 정제합니다. 자기를 파괴하는 항체 칵테일이 결합된 비 CD8+ T 세포를 제거하여 CD8⁺ T 세포를 분리하고 농축합니다. 정제된 OT-1 CD8+ naive T cell을 HBSS에 2 x 10⁶ cells/mL로 재현탁하고 사용하기 전에 얼음에 보관합니다.
2. 리간드 또는 도금 세포를 추가하기 전에 품질 관리를 위해 형광 현미경(100x 대물렌즈)으로 DNA 헤어핀 장력 프로브 표면의 품질을 확인하십시오. DNA 헤어핀 장력 프로브 표면의 Cy3B 채널의 평균 배경 강도를 최소 5개의 서로 다른 위치와 3번의 반복에서 이미지화하고 정량화합니다. 이 값이 표면 품질 및 프로브 밀도의 신뢰할 수 있는 마커로 사용될 수 있도록 이미징 획득 조건을 일관되게 유지합니다(그림 3C).
   메모: 문헌에 따라 금 나노 입자 당 DNA 가닥 수와 μm² 당 금 나노 입자 수를 표면 준비의 처음 몇 번 정량화하여 표면 품질의 또 다른 신뢰할 수있는 마커로 사용할 수 있습니다.
3. ~4 x 10⁴ - 10 x 10⁴ 세포를 각 DNA 장력 프로브에 플레이트화하고 실온에서 ~15분 동안 부착 및 확산되도록 합니다.
4. 세포가 DNA 헤어핀 장력 프로브에 도금되고 확산되기 시작하면 100x 대물렌즈를 사용하여 Cy3B 채널에서 생성된 형광 신호를 이미지화합니다(그림 2I).
5. 세포가 Cy3B 채널의 DNA 헤어핀 장력 프로브 표면에서 실시간 장력 신호를 생성하기 시작한 후 Cy3B 및 Atto647N 채널 모두에서 이미지를 획득합니다(TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경은 에피 형광보다 더 나은 신호 대 잡음비를 제공합니다). 그런 다음 기계적으로 선택적인 혼성화를 위해 최종 농도 200nM에서 Atto647N strand를 이미징 챔버에 추가합니다.
6. 10분 배양 후 형광 Atto647N 잠금 가닥이 포함된 완충액을 빠르고 부드럽게 제거하고 신선한 Hank's Balanced Salts로 교체합니다. Cy3B 및 Atto647N 채널 모두에서 이미지를 다시 생성하고 Fiji 소프트웨어와 Pearson의 상관 계수를 결정합니다.
7. 조사의 관심 시점에 이미징 챔버의 세포에 비형광 잠금 가닥을 도입하여 장력 신호를 저장합니다. 잠금 가닥 스톡(100μM)을 준비하고 최종 농도 1μM에서 세포에 추가합니다. 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 잠금 시간은 다를 수 있지만 권장 시간은 10분입니다.
8. 필요에 따라 정성적 장력 매핑과 정량적 분석을 위해 에피형광에서 타임랩스 동영상 또는 끝점 이미지를 획득합니다(그림 2J 및 그림 4).
   메모: 여러 시점에서 장력 측정이 필요한 경우 잠금 해제 스트랜드를 추가하여 저장된 장력 신호를 지우기 시작합니다. 과도한 헹굼을 피하기 위해 2μM에서 잠금 해제 스트랜드의 더 높은 최종 농도를 사용하여 3분 동안 잠금 스트랜드와 발가락 매개 스트랜드 변위 반응을 시작하여 저장된 신호를 지웁니다(그림 2J). HBSS로 과도한 올리고뉴클레오티드를 부드럽게 헹굽니다. DNA 헤어핀 장력 프로브 표면과 세포는 또 다른 장력 저장 및 매핑을 위해 준비됩니다. 연구에서 하나의 시점만 관심을 갖는 경우 장력 신호를 잠금 해제할 필요가 없습니다.

결과

그림 1: 올리고뉴클레오티드 제제의 예.(A) Cy3B 리간드 가닥 정제의 HPLC 크로마토그램; (B) 제품의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼; (C) 계산된 질량 및 출발 물질의 발견된 m/z 피크 및 표지된 올리고뉴클레오티드의 표.

그림 2: DNA 장력 프로브 기질의 기능화 및 실험 절차. 단계는 해당 프로토콜에 설명되어 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3-하이드록시피콜린산(3-HPA)	시그마	56197	말디-TOF-MS 매트릭스
엠페그-사우스캐롤라이나	비오켐페프	MF001023-2케이	표면 준비
(3-아미노프로필)트리에톡시실란	아크로스	AC430941000	표면 준비
10x 적혈구 용해 완충액	바이오레전드	전화: 00-4333-57	완충기
8.8nm 금 나노 입자, 탄닌산	나노콤포식스	맞춤 주문	표면 준비
Atto647N NHS 에스테르	시그마	18373-1MG-F	형광단, 올리고 준비
Attofluor Cell Chamber, 현미경 검사용	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A7816	이미징
BD 주사기는 Luer-Lok에서만 가능합니다.	BD 생명과학	309657	셀
비오틴화 안티 마우스 CD3e	이바이오사이언스	Tel.: 13-0031-82	항체/ligand
비오틴화 pMHC 오브알부민(SIINFEKL)	에모리 대학교의 NIH 테트라머 핵심 시설	해당 없음	항체/ligand
소 혈청 알부민	시그마	735078001	불특정 상호 작용 차단
세포 스트레이너	바이오로직스	15-1100	셀
커버슬립 미니 랙, 테프론	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	C14784	표면 준비
Cy3B NHS 에스테르	GE 헬스케어	PA63101	형광단, 올리고 준비
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	코 닝	21-031-CM	완충기
에탄올	시그마	459836	표면 준비
행크스 밸런스 솔트(HBSS)	시그마	H8264	완충기
과산화수소	시그마	H1009	표면 준비
라페그-SC	비오켐페프	HE039023-3.4케이	표면 준비
Midi MACS(LS) 스타트업 키트	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-301	셀
마우스 CD8+ T 세포 분리 키트	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-104-075	셀
Nanosep MF 원심 장치	Pall 연구소	ODM02C35	올리고 준비
No. 2 라운드 유리 커버 슬립	폭스바겐	제48382-085	표면 준비
NTA-샘	도진도 분자 기술	N475-10	표면 준비
P2 젤	바이오 라드	1504118	올리고 준비
황산	EMD 밀리포어 코퍼레이션	SX1244-6	표면 준비
설포 NHS 아세테이트	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	26777	표면 준비
설비
Agilent AdvanceBio 올리고뉴클레오타이드 C18 컬럼, 4.6 x 150mm, 2.7μm	제653950-702		올리고뉴클레오타이드 제제
Barnstead 나노 순수 정제 시스템	써모 피셔		물
CFI Apo 100× NA 1.49 목표	니콘		현미경 검사 법
Cy5 큐브	크로마		현미경 검사 법
진화 전자 증식 전하 결합 소자(EMCCD)	포토메트릭스		현미경 검사 법
고성능 액체 크로마토그래피	애질런트 1100		올리고뉴클레오타이드 제제
Intensilight epifluorescence 소스	니콘		현미경 검사 법
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석기(MALDI-TOF-MS)	보이저 STR		올리고뉴클레오타이드 제제
Nanodrop 2000 UV-Vis 분광 광도계	써모 피셔		올리고뉴클레오타이드 제제
Nikon Eclipse Ti 도립 현미경	니콘		현미경 검사 법
니콘 퍼펙트 포커스 시스템	니콘		현미경 검사 법
NIS Elements 소프트웨어	니콘		현미경 검사 법
쿼드 밴드 TIRF 405/488/561/647 큐브	크로마		현미경 검사 법
RICM 큐브	크로마		현미경 검사 법
488nm(50mW), 561nm(50mW) 및 640nm의 TIRF 런처	간섭성의		현미경 검사 법
TRITC 큐브	크로마		현미경 검사 법
올리고 이름	5' 수정 / 3' 수정	시퀀스 (5' - 3')	쓰다
15mer 아민 잠금 가닥	5 '수정 : 수정 없음 3' 수정: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	실시간 장력 신호 잠금
15mer Atto647N 잠금 가닥	5' 수정: Atto647N 3' 수정: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	실시간 장력 신호 잠금
15mer 비형광 잠금 가닥	5 '수정 : 수정 없음 3 '수정 : 수정 없음	A AAA AAC ATT TAT AC	정량 분석을 위한 실시간 장력 신호 잠금
4.7pN 헤어핀 스트랜드	5 '수정 : 수정 없음 3 '수정 : 수정 없음	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC (영문	헤어핀 프로브
아민 리간드 가닥	5' 수정: /5AmMC6/ 3' 수정: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	헤어핀 프로브
BHQ2 앵커 스트랜드	5' 수정: /5ThiolMC6-D/ 3' 수정: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	헤어핀 프로브
Cy3B 리간드 가닥	5' 수정: Cy3B 3' 수정: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	헤어핀 프로브
스트랜드 잠금 해제	5 '수정 : 수정 없음 3 '수정 : 수정 없음	태그: GTA, GGG, 탓, AAA, TGT, TTT, TTT, C	축적된 장력 신호 잠금 해제

년 ) 년 ) 호 ) 호 ) ,