인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. A. fumigatus 문화와 조건
- 설명된 대로 포도당 최소 한천 배지를 준비합니다.
- 1M 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 매체를 pH 6.5로 조정하고 120°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
- 65 °C로 식히십시오.
- 멸균 흐름 후드에서 작업하면서 냉각된 매체 30mL를 T75 플라스크에 붓고 플라스크 목을 25mL 피펫에 올려 놓은 상태에서 냉각시켜 한천 경사를 만듭니다.
- 한천에 dsRed Af293-Aspergillus fumigatus 균주를 줄무늬를 만들고 37 ° C + 5 % 이산화탄소 (CO2)에서 7 일 동안 배양합니다. 두 개의 플라스크는 5mL 인산염 완충 식염수(PBS) 비오틴화 전에서 약 109 분생분포자를 생성합니다.
2. A. fumigatus 라벨링 및 준비
참고: 이 분석을 처음 수행하는 경우 parent Af293-A. fumigatus 균주를 준비하십시오. 마이크로 원심분리 튜브에서 두 균주의 샘플을 채취하고 아래 설명된 대로 각 균주 중 하나만 표시합니다. 이를 통해 색상이 없는 분생포자와 dsRed 또는 Alexa Fluor 633(AF633)과 같은 단일 색상으로 분생포자를 제어하여 설정 및 장비를 테스트할 수 있습니다.
- 배양물을 30mL PBS + 0.05% Tween-80으로 침지하여 A. fumigatus conidia를 수확합니다. 생성된 현탁액을 40μm 세포 여과기를 통해 50mL 튜브로 여과하여 균사 단편을 제거합니다.
- 805 x g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거하고 멸균 PBS 20mL에 한 번 세척합니다. 세척 단계에서 동일한 균주의 두 플레이트에서 수영장 분생포자.
- 세척 단계 후, 펠릿을 PBS 5mL에 재현탁시키고 분취액 1mL를 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.일반적으로 각 균주의 현탁액 1mL는 라이브 셀 이미징에 충분합니다. 남은 부분 표본을 호일로 싸서 4°C에서 보관합니다.
- 원뿔형 현탁액의 원심분리기 분취액을 실온에서 10분 동안 9,300 x g에서 추출하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. conidial 펠렛을 1mL, 0.05M, 중탄산나트륨(NaHCO3), pH 8.3에 재현탁합니다.
- 500μL DMSO에서 25mg 비오틴을 재용해하여 10mg 비오틴/200μL 디메틸설폭사이드(DMSO) 원액을 준비합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 10μL 비오틴/DMSO 원액을 추가하고 알루미늄 호일로 덮은 다음 4°C의 로커에서 2시간 동안 배양합니다.
- 나머지 비오틴/DMSO 원액을 분취하고 후속 실험에 사용하기 위해 -20°C에서 동결합니다.
- 9,300 x g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 분생포자 펠렛을 100mM Tris(하이드록시메틸) 아미노메탄-염산염(Tris-HCl) pH 8.0 1mL에 1시간 동안 재현탁시켜 자유 부유 비오틴을 비활성화합니다.
- 9,300 x g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 1mL의 멸균 PBS로 펠릿을 두 번 세척하고 1mL의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
- 1mg의 Streptavidin-AF633을 PBS 0.5mL에 용해시켜 2mg/mL의 원액을 만듭니다. conidial 현탁액 1mL당 2mg/mL streptavidin-AF633 10μL를 추가하고 알루미늄 호일로 덮인 로커에서 실온에서 40분 동안 배양합니다. 나머지 Streptavidin-AF633은 후속 실험에 사용하기 위해 분취액에서 동결할 수 있습니다.
- 9,300 x g에서 10분간 원심분리기를 하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 분생포자 펠릿을 1mL의 PBS에 재현탁하고 혈구계를 사용하여 1:1,000 희석(1:100 및 1:10)으로 분생포자를 계수합니다. CO2 독립 배지를 사용하여 원추형 농도를 3.6 x 106/mL로 조정하고 호일로 싸서 4°C에서 보관합니다.
메모: 분생포자는 이제 AF633으로 표시되며 FLuorescent Aspergillus REporter(FLARE) 분생포자라고 합니다.
- 선택 사항: 팽윤된 분생포자를 통한 자극이 필요한 경우, 분생포자를 계수한 후(2.9단계), 효모 질소 염기(YNB) 배지에서 분생포자를 7.2 x 106/mL로 희석하고 오토클레이브 50mL 삼각 플라스크에서 4.5mL YNB 배지에 500μL 분생식 현탁액을 추가합니다. 플라스크를 덮고 진탕 인큐베이터(200°C에서 37rpm)에 6시간 동안 놓습니다.
- 배지를 15mL 튜브로 옮깁니다. 805 x g에서 실온에서 10분 동안 원심분리기를 사용하고 PBS에서 한 번 세척합니다. 다시 원심분리기를 하고 펠릿을 1mL CO2 독립 배지에 재현탁시켜 3.6 x 106 conidia/mL.
제공합니다.
참고: 분생포자는 부풀어 오른 후 자주 뭉쳐서 정확한 계산을 어렵게 만들며, 사용된 휴지 분생포자의 계수된 수로 계산하는 것이 좋습니다.
3. 인간 호중구 및 단핵구의 분리
- 건강한 지원자의 정맥혈 20mL를 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함된 10mL 혈액 튜브 2개에 채취합니다. 각 헌혈자에 대해 개별적으로 20mL의 혈액을 50mL 튜브에 붓고 15mL PBS로 희석합니다.
- 주사기와 철 바늘로 15mL의 림프구 분리 용액(밀도 1.077g/mL)을 혈액 밑에 놓습니다. 바늘을 튜브 바닥에 놓고 림프구 분리 용액을 부드럽게 밀어냅니다. 630 x g에서 20분 동안 브레이크 없이 낮은 가속으로 원심분리기.
- 얼음에 식힌 PBS를 준비합니다.
메모: 3.4단계와 3.5단계를 동시에 따라야 단핵구(3.4)와 호중구(3.5) 가 생성됩니다.
- 페이스트를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 층을 수확합니다. 이 층은 노란색 혈청(위)과 투명 림프구 분리 용액(아래) 층 사이의 중앙에 있는 층으로, 새로운 50mL 튜브로 이동합니다.
- 차가운 PBS로 튜브를 최대 50mL까지 채우고 582 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 차가운 PBS로 두 번 세척한 후 처음에 사용한 헌혈자 혈액 20mL당 PBS 1mL에 재현탁합니다.
- 160μL의 PBS와 20μL의 트리판 블루에 20μL의 세포 현탁액을 첨가하여 계수를 위한 1:10 희석을 만듭니다. 혈구계(hemocytometer)로 세포를 세십시오.
- 500mL의 Hank's balanced salt solution(HBSS)에 26mL의 열비활성화 태아 송아지 혈청(FCS)과 2.1mL의 0.5M EDTA를 첨가하여 완충 용액을 준비합니다. 515 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 1 x 107 세포당 40μL의 완충 용액에 재현탁합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 1 x 107 세포당 10μL의 CD14 마이크로비드를 첨가하고 잘 혼합한 다음 4°C에서 15분 동안 배양하고 5분마다 튜브를 혼합합니다.
- 1 x 107 셀당 1mL의 완충 용액을 첨가하고 515 x g에서 10분 동안 원심분리하여 셀을 세척합니다.
- 상층액을 완전히 흡인하고 500μL의 완충 용액에 최대 1 x 108 세포를 재현탁합니다.
- 샘플당 1개의 열을 제조업체의 지침에 따라 자기 분리기에 놓습니다. 먼저 500μL의 완충 용액으로 컬럼을 한 번 세척합니다.
- 500μL의 세포 현탁액을 컬럼을 통해 피펫팅하고 컬럼이 마를 때까지 기다린 다음 완충 용액으로 3회 반복하여 세척합니다.
- 컬럼 아래에 새 15mL 튜브를 놓고 마그네틱 분리기에서 컬럼을 분리합니다. 그런 다음 1mL의 완충 용액을 사용하여 컬럼에서 튜브로 세포를 플러시합니다.
- 4mL의 완충 용액과 원심분리를 515 x g에서 10분 동안 첨가한 다음 1mL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지에 재현탁합니다.
- 160μL의 PBS와 20μL의 트리판 블루에 20μL의 세포 현탁액을 첨가하여 계수를 위한 1:10 희석을 만듭니다. 혈구계로 세포를 세십시오.
- RPMI를 사용하여 세포 농도를 6 x 105/mL로 조정하고 35mm 유리 기반 이미징 접시에 200μL를 시드합니다. 37 ° C에서 5 % CO2로 밤새 배양하십시오.
- 다음 날, 이미징 전에 RPMI를 제거하고 200μL의 CO2 독립 배지를 추가합니다.
메모: 이러한 단핵구는 이미징 전에 다양한 대식세포 subset으로 구별될 수도 있습니다. 이것이 탐구해야 할 기술이라면, 훌륭한 출발점은 Ohradanova-Repic et al.의 최근 논문입니다.
- PBMC 층을 채취한 후 모든 혈청과 대부분의 림프구 분리 용액을 제거하되 대부분의 호중구를 포함할 수 있으므로 빨간색 펠릿 위에 있는 작은 흰색 띠를 제거하지 않도록 주의하십시오.
- 멸균수 1L에 염화암모늄 83g(NH4Cl)과 중탄산칼륨 10g(KHCO3)을 첨가하여 10x 저장성 용해 완충액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 이 스톡을 멸균수로 10배 희석하여 튜브에 넣습니다. 그런 다음 조심스럽게 3회 뒤집어 얼음 속에서 15분 동안 배양합니다.
- 394 x g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 얼음에서 10분 동안 저장성 용해 완충액에 재현탁합니다.
- 394 x g에서 원심분리기를 만들고 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 공여체당 1mL의 CO2-독립 배지에 재현탁합니다.
- 160μL의 PBS와 20μL의 트리판 블루에 20μL의 세포 현탁액을 첨가하여 계수를 위한 1:10 희석을 만듭니다. 혈구계로 세포를 세십시오.
- 현미경 검사의 경우, 35mm 유리 기반 이미징 접시에 동일한 세포 현탁액 200μL를 추가합니다.
참고: 호중구 이미징 또는 유세포 분석은 자극하지 않고 방치하면 세포사멸을 겪는 경향이 있으므로 즉시 시작해야 합니다. 이것이 가능하지 않은 경우 호중구를 얼음 위에 보관하고 가능한 한 빨리(당일 이내에) 사용해야 합니다.
4. 라이브 셀 비디오 현미경
참고: 현미경의 선택은 현지에서 사용할 수 있는 항목에 따라 다르지만 현미경 설정에는 반전 스테이지, 37°C로 가열된 환경 챔버 및 dsRed(532/561nm) 및 AF633(633nm)에 대한 적절한 여기/방출 필터가 포함되어야 합니다.FLARE 분생포자는 dsRed용 532/561nm 레이저 대신 488nm 레이저에서 작동하지 않습니다. 이 실험을 처음 수행하는 경우 색상이 없는 대조 분생포자와 단색을 사용하여 dsRed와 AF633 채널 사이의 배경 형광 및 블리드 스루를 테스트합니다.
- 실험 전에 현미경 히터를 켜고 환경 제어 챔버가 37°C로 예열될 때까지 충분한 시간을 기다립니다. 챔버 온도가 안정화되는 데 걸리는 시간은 현미경 설정에 따라 다릅니다.
- 현미경과 컴퓨터를 켜고 이미징 소프트웨어를 로드합니다. 이미징 접시를 현미경 스테이지에 장착하고 초점을 조정하여 인간 호중구 또는 단핵구를 찾습니다.
- dsRed 및 AF633의 경우 획득 설정에서 레이저 출력을 10%로 설정하고 노출 시간을 1초로 설정합니다.
- 이미징 슬라이드를 제거하고 100μL의 3 x 106/mL FLARE 코니다이얼 현탁액을 적절한 웰(총 부피 300μL/웰)에 추가합니다. FLARE 분생포자(FORE)가 접시에 추가되는 시간을 기록합니다.
- 슬라이드를 스테이지로 되돌리고 dsRed 및 AF633의 카메라 감도를 조정하여 코니디아를 명확하게 보지만 이미지를 과도하게 노출하지 않도록 합니다. 멀티 포인트 획득이 필요한 경우 스테이지 포인트 목록을 설정합니다.
- 모든 지점에 초점이 맞춰지고, 채널이 최적화되고, 주기 시간과 지속 시간이 설정되면 이미징을 시작합니다. 이미징의 주기 시간과 지속 시간은 실험 질문에 따라 다릅니다. 목표는 사이클 시간을 가능한 한 짧게(≤2분) 유지하고 1분으로 흡수 역학을 심층적으로 분석할 수 있도록
하는 것입니다.
