비드 지지 지질 이중층을 활용하여 T 세포의 시냅스 출력 조사

초록

출처: Céspedes, P. F., et al. T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위한 비드 지지 지질 이중층 준비. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오는 Bead-Supported Lipid Bilayers를 통한 합성 항원 제시 세포의 재구성과 활성화된 T 세포에 의해 생성된 시냅스 출력을 평가하는 데 적용되는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. BSLB(비드 지지 지질 이중층)의 단백질 밀도 보정

1. 5.00 ±0.05 μm 직경의 비기능성 실리카 비드를 복용하기 전에 원액을 잘 혼합하고 플라스크 바닥에 침전된 큰 비드 덩어리를 다시 현탁시킵니다.
   참고: 실리카 비드는 빠르게 침전되는 경향이 있어 계산 오류가 발생할 수 있습니다. P1000 마이크로피펫 최대 부피의 절반을 위아래로 피펫팅하여 격렬하게 혼합합니다.
2. 1μL의 비드 용액을 1,000μL의 PBS에 희석하고, 혈구계 챔버를 사용하여 비드를 계수하고, mL.
   당 농도를 계산합니다. 메모: 실리카 비드를 시각화하는 데 Trypan blue 염색이 필요하지 않습니다.
3. 적정 포인트당 5 × 10^{5 최종} BSLB에 필요한 실리카 비드의 부피를 계산합니다.
4. 필요한 부피의 실리카 비드를 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. 1mL의 멸균 PBS로 실리카 비드를 3회 세척하고 RT(고정 rpm)의 탁상형 마이크로 원심분리기에서 비드를 15초 동안 원심분리합니다.
   알림: 세척액을 제거할 때 비드 펠릿을 방해하지 마십시오. 작은 완충액 컬럼은 리포좀 마스터 믹스를 구성하는 리포좀의 확산에 영향을 미치지 않으며, 이는 PBS에도 있기 때문입니다.
6. 세척된 실리카 비드에 BSLB를 조립하기 위해 리포좀 마스터 믹스의 3가지 부피를 준비합니다(예: 실리카 비드의 초기 총 부피가 20μL인 경우 최소 60μL의 리포좀 마스터 믹스를 준비).
7. Biotinyl Cap PE mol% 적정용
   1. Biotinyl Cap PE의 5배 희석액을 함유한 지질 마스터 믹스를 준비합니다.
      1. 0.4mM Biotinyl Cap PE mol%를 100% DOPC 매트릭스에 희석합니다.
      2. 각 Biotinyl Cap PE mol% 적정점을 1:1(vol: vol) 비율로 0.4 mM 25% DGS-NTA(Ni) 용액과 혼합하여 모든 적정에서 최종 12.5 mol%의 Ni 함유 지질이 존재하도록 합니다.
         메모: Ni 함유 지질의 12.5 mol%(vol:vol%)는 BSLB의 혼합 지질 조성을 나타내며, His-tagged 단백질도 병렬 보정에서 테스트할 수 있습니다. 예를 들어, 모든 리포좀 스톡은 동일한 몰 농도에서 준비되기 때문에 200μL의 최종 리포좀 혼합물에서 목표 mol% 혼합물에 도달하려면 100μL의 Ni 함유 DGS-NTA 100μL와 100 mol% DOPC를 혼합하기만 하면 됩니다.
   2. 5 × 10⁵ 세척된 실리카 비드를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 튜브당 하나의 Biotinyl Cap PE mol% 적정점이 조립되도록 합니다.
   3. 세척된 실리카 비드에 Biotinyl Cap PE mol% 적정 마스터 믹스를 추가하고 총 부피의 절반을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 지질 이중층을 과도하게 파괴하는 기포를 형성하지 마십시오.
   4. 현재 형성되고 있는 BSLB가 들어 있는 튜브에 아르곤(또는 질소) 가스를 추가하여 공기를 대체하고 혼합 중 지질이 산화되지 않도록 보호합니다.
   5. 보관 전에 0.4mM 지질 스톡에 아르곤을 첨가하고 멸균 기술을 사용하여 조작합니다.
      메모: 아르곤/질소 가스 실린더에 작은 튜브를 연결합니다. 튜브에 가스를 추가하기 전에 압력이 2psi 이하로 설정되도록 가스 실린더 조절기를 조정하십시오. 멸균 피펫 팁을 배출 튜브에 연결하여 5초 동안 가스 흐름을 리포좀 스톡으로 향하게 하고 뚜껑을 빠르게 닫습니다. 지질 스톡의 경우 4°C에서 보관하기 전에 튜브 뚜껑을 파라핀 필름으로 밀봉하십시오.
   6. BSLB를 수직 가변 각도 실험실 믹서(재료 표 참조)로 옮기고 10rpm.
      의 궤도 혼합을 사용하여 RT에서 30분 동안 혼합합니다. 메모: 이 단계는 지지된 지질 이중층이 형성되는 동안 비드의 침강을 방지합니다.
   7. 벤치탑 미니 원심분리기에서 RT에서 15초 동안 원심분리하여 비드를 스핀다운한 다음 1mL의 HBS/HSA(BSA)로 3회 세척하여 과도한 리포좀을 제거합니다.
   8. 100μM의 NiSO₄를 함유한 5% 카제인 1mL 또는 5% BSA를 첨가하여 NTA 부위를 포화시키고 200nM 스트렙타비딘을 첨가하여 BSLB의 모든 비오틴 고정 부위를 균일하게 코팅하여 형성된 BSLB를 차단합니다. 총 부피의 절반을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 RT 및 10rpm에서 20분 이상 수직 믹서에서 배양합니다.
   9. 벤치탑 미니 원심분리기에서 RT에서 15초 동안 원심분리하여 BSLB를 회전시킨 다음 1mL의 HBS/HSA(BSA) 버퍼로 3회 세척합니다.
      메모: BSLB를 덮는 소량의 세척 버퍼로 세척된 비드를 수직으로 유지하십시오. 공기가 지질 이중층을 파괴하므로 BSLB의 탈수를 피하십시오.
8. DGS-(Ni) NTA 함유 BSLB 12.5 mol%에 대한 His 태그 단백질의 적정
   1. DGS-NTA(Ni)의 최종 12.5 mol%를 함유하는 리포좀 마스터 믹스 3부피를 준비합니다.
   2. 리포좀 마스터 믹스를 사용하여 세척된 실리카 비드를 다시 현탁시키고 전체 부피의 절반을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 지질 이중층을 과도하게 손상시키는 기포를 형성하지 마십시오.
   3. 현재 형성되고 있는 BSLB가 들어 있는 튜브에 아르곤(또는 질소) 가스를 추가하여 공기를 대체하고 혼합 중 지질이 산화되지 않도록 보호합니다.
   4. 보관 전에 0.4mM 지질 스톡에 아르곤을 첨가하고 멸균 기술을 사용하여 조작합니다.
   5. BSLB를 수직 믹서로 옮기고 10rpm에서 오비탈 믹싱을 사용하여 RT에서 30분 동안 믹싱합니다.
   6. 벤치탑 미니 원심분리기에서 RT에서 15초 동안 원심분리하여 비드를 스핀다운한 다음 1mL의 HBS/HSA(BSA)로 3회 세척하여 과도한 리포좀을 제거합니다.
   7. BSLB의 NTA 부위를 포화시키기 위해 100μM의 NiSO4를 함유한 5% 카제인(또는 5% BSA) 1mL를 첨가하여 형성된 BSLB를 차단합니다. 부드럽게 혼합하고 수직 믹서에서 RT 및 10rpm에서 20분 이상 배양하지 마십시오.
   8. HBS/HSA(BSA)를 사용하여 세 번 세척하여 과도한 차단 용액을 제거합니다.
   9. 새로운 U-bottom 96-well 플레이트에서 단백질의 2배 연속 희석을 준비합니다.
      1. 총 부피 200μL의 HBS/HSA(BSA) 완충액에서 관심 단백질에 대해 100nM의 시작 농도를 준비하고, 이 용액 100μL를 첫 번째 컬럼에 분배하고, 나머지 100μL는 100μL의 HBS/HSA(BSA) 완충액을 포함하는 컬럼 #2 위에 분배합니다.
      2. 컬럼 #2에서 컬럼 #3으로 100 μL를 연속으로 전달하여 계속하고 모든 적정점을 커버하기 위해 필요에 따라 반복합니다. 계열의 마지막 열은 단백질이 없는 상태로 두는데, 이는 정량화를 위한 빈 참조로 사용되므로 됩니다.
   10. 100μL의 HBS/HSA(BSA) 버퍼에 5 × 10⁵ BSLB가 포함되도록 준비된 BSLB를 재현탁합니다.
   11. BSLB 현탁액 100μL를 두 번째 U-bottom 96웰 플레이트의 웰로 이송하여 각 웰이 5 × 10⁵ BSLB를 수용하도록 합니다.
   12. BSLB가 들어있는 두 번째 플레이트를 300 × g에서 2 분 동안 스핀 다운하고 상층액을 버립니다.
   13. 단백질 적정 플레이트에서 100 μL 부피를 침전된 BSLB가 포함된 플레이트로 옮깁니다. 부드럽게 혼합하고, 파이펫팅하는 동안 과도한 기포가 생성되지 않도록 하며, 플레이트 셰이커를 사용하여 RT 및 1,000 rpm에서 30분 동안 배양합니다. 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하십시오.
   14. RT에서 2분 동안 300 ×g의 침전 단계를 사용하여 HBS/HSA(BSA) 버퍼로 플레이트를 세 번 세척합니다.
   15. 검량에 사용된 재조합 단백질이 형광 색소에 직접 접합되고 F/P 값을 알고 있는 경우.
   16. 검량에 사용된 재조합 단백질이 표지되지 않았거나 형광 색소에 접합되어 있거나 MESF 비드 표준물질을 사용할 수 없는 경우, 알려진 F/P 값을 가진 Alexa Fluor 488 또는 647 접합 항체를 사용하여 단백질 코팅된 BSLB를 염색합니다.
   17. 정량화 항체의 포화 농도를 가진 염색.
       참고: 타겟 발현 수준에 따라 5 - 10 μg/mL 사이입니다.
   18. 플레이트 셰이커를 사용하여 RT 및 1,000rpm에서 30분 동안 염색합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하십시오.
   19. RT.
       에서 2분 동안 300 × g의 침전 단계를 사용하여 HBS/HSA(BSA) 버퍼로 두 번, PBS로 한 번 세척합니다. 메모: PBS, pH 7.4를 사용하여 획득하기 전에 세척된 BSLB를 재현탁합니다. 단백질이 함유된 완충액은 고처리량 샘플러와 샘플을 자동으로 혼합하는 동안 기포를 형성할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
   20. MESF 표준을 획득하여 그림 1B(vii)와 같이 가장 밝은 피크가 정량화 검출기(채널)의 선형 검출 범위에 남아 있는지 확인합니다.
   21. 수동으로 또는 HTS를 사용하여 샘플을 획득합니다. 후자를 사용하는 경우 100μL의 PBS에 BSLB를 재현탁하고 2.5에서 3.0μL/s 사이의 유속, 100μL의 혼합 부피(또는 재현탁 부피가 더 적은 경우 총 부피의 50%), 150μL/s의 혼합 속도 및 BSLB가 단분산되도록 하는 5개의 혼합물을 사용하여 80μL를 획득합니다.
   22. FCS 파일을 내보냅니다.
   23. 분석을 위해 단일 이벤트(그림 2A)에 초점을 맞추는데, 이중선 또는 삼중항은 결정에 오류를 발생시키므로 발생합니다. 프로토콜 단계 1.2.3에 표시된 대로 단일 이벤트의 중첩된 ID를 사용합니다.
   24. 각 MESF 분획(1-4)의 MFI를 측정하고 빈 비드의 MFI를 빼서 보정된 MFI(cMFI)를 추출합니다.
   25. 선형 회귀 분석을 수행하여 MESF 표준에 대해 계산된 cMFI에 대한 MESF의 기울기(b)를 추출합니다.
   26. 각 적정점의 MFI를 추출하고 단백질이 없는 비드의 MFI를 빼서 cMFI를 얻습니다.
   27. cMFI를 계산된 기울기로 나누어 각 적정점에 대해 BSLB에 바인딩된 MESF를 추출합니다.
   28. BSLB에 결합된 MESF를 정량화 항체의 F/P 값으로 나누어 BSLB당 결합된 평균 분자 수를 추출합니다.
   29. BSLB의 직경(5.00 ± 0.05 μm)을 사용하여 비드 표면적(SA = 4pr2)을 추출하여 적정점(단백질 농도)당 단백질(molec./μm²)의 최종 밀도를 계산합니다.
   30. 단백질 밀도에 대한 단백질 농도의 새로운 회귀 분석을 수행하여 최적선의 기울기(b)를 계산합니다.
       메모: 12.5 mol%의 DGS-NTA(Ni) 농도는 T 세포의 비특이적 활성화를 유도하거나 SLB의 측면 이동성에 영향을 미치지 않고 약 10,000 molec./μm2 10의 최대 고정 용량을 제공합니다.

2. T 세포와 BSLB 간의 시냅스 전달 실험 수행

1. 시냅스 전달 실험을 실행하기 전에
   1. 비형광 BSLB, 형광 지질이 있는 BSLB, 염색되지 않은 세포(또는 염색되지 않은 세포, 재료 표 참조) 및 단색 염색 세포(또는 보상 비드)를 획득하여 기기의 형광 스펙트럼 상호 작용을 식별합니다. 스필오버 확산이 높은 검출기에 집중하여 다색 패널을 재설계하고, 감도를 높이고, 중요한 검출기의 측정 오류를 줄이십시오.
   2. 검출 항체를 적정하여 최적의 농도를 찾으면 음성 검출을 손상시키지 않으면서 양성 이벤트를 검출할 수 있습니다.
      메모: F/P 값과 밝기가 배치마다 다르므로 항체 로트가 변경될 때마다 이 단계를 반복합니다.
   3. 선택 사항: 서로 다른 전압 범위(즉, 전압 워크)에서 샘플을 획득하여 PMT 전압을 최적화하여 최적의 신호 오버 노이즈(즉, 가장 밝은 모집단의 신호가 선형 범위에 유지되도록 하면서 음수와 양수 분리)로 이어지는 PMT를 찾습니다.
2. BSLB로의 T-cell 출력 전달 측정
   1. 10%의 열불활성화 소 태아 혈청(FBS), 100μM 비필수 아미노산, 10mM HEPES, 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨, 100U/ml의 페니실린 및 100μg/mL의 스트렙토마이신을 함유하는 보충된 RPMI 1640(본 참조의 R10 배지)을 제조한다. R10 배지를 사용하여 T 세포를 배양하고 확장시킵니다.
   2. 1일차에는 말초 혈액 또는 백혈구 축소 시스템(LRS) 챔버에서 T 세포를 분리합니다. 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 농축을 위해 면역밀도 세포 분리 및 분리 키트(재료 표 참조)를 사용합니다.
   3. 웰당 총 5mL 이하의 6-well plate를 사용하여 1.5 - 2.0 × 10⁶ cells/mL 범위의 최종 농도로 세포를 시딩합니다.
   4. 인간 T 세포 활성화(anti-CD3/anti-CD28) 마그네틱 비드(재료 표 참조)의 1:1 비율을 사용하여 T 세포를 활성화하고 100IU의 재조합 인간 IL-2를 추가하여 세포 증식 및 생존을 지원합니다.
   5. 3일차에는 자기 기둥을 사용하여 활성화 자기 비드를 제거합니다(재료 표 참조). 추가 세척 단계를 위해 세포를 회수하기 전에 마그네틱 비드가 튜브 측면에 부착되어 있는지 확인하십시오.
   6. 새 R10 배지 5mL로 마그네틱 비드를 한 번 더 씻고 잘 섞은 다음 자석에 다시 넣습니다. 이 부피를 회수하고 1.2.5단계에서 회수된 세포와 혼합합니다.
   7. 100 U/mL의 IL-2를 함유하는 신선한 R10에서 세포를 1.5-2 ×^{10 6} cells/mL로 재현탁합니다. 48시간 후에 배지를 보충하고 IL-2의 마지막 첨가가 실험일 48시간 전(배양 7-14일)인지 확인합니다.
   8. 시냅스 전달 실험 당일, 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 배지에 10% FBS, 100μM 비필수 아미노산, 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨, 페니실린 100U/ml 및 스트렙토마이신 100μg/mL를 보충하여 시냅스 전달 분석 배지를 준비합니다. 재조합 인간 IL-2는 포함하지 마십시오.
   9. 트리판 블루 염색 또는 전류 배제를 사용하여 세포를 계수하고 배지에서 2.5 × 10⁶ cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다. 과도한 세포 사멸이 관찰되면(>10%), 다음과 같이 다당류와 디아트리조산 나트륨의 혼합물을 사용하여 죽어가거나 죽어가는 세포를 제거합니다(재료 표 참조).
      1. 다당류-디아트리조산 나트륨 용액 13mL 위에 세포 배양 15mL를 겹겹이 쌓습니다.
      2. 최소 가속 및 감속으로 RT에서 20분 동안 1,250 × g의 원심분리기. 배지와 다당류-나트륨 디아트리조산 용액 사이의 계면에서 세포층(구름)을 수집합니다.
      3. 예열된 Synaptic Transfer Assay 배지(1.2.7단계에서 준비)로 세포를 최소 두 번 세척합니다.
      4. Synaptic Transfer Assay 배지를 사용하여 세포를 2.5 × 10⁶/mL의 최종 농도로 계수하고 재현탁합니다. 이 세포 현탁액 100μL를 BSLB와 공동 배양합니다(단계 1.2.15 참조).
   10. 실험에 필요한 BSLB의 수를 계산하고, 테스트할 다양한 단백질 마스터 믹스 및 항원 적정(비오틴화 HLA/MHC-펩타이드 단량체 또는 모노비오틴화 항-CD3ε Fab)을 모두 고려하십시오.
   11. 프로토콜 섹션 5와 동일한 단계에 따라 BSLB를 조립하되 이번에는 복잡한 APC 멤브레인을 재구성하는 데 필요한 단백질과 지질의 모든 적정을 결합합니다(그림 3A). 초기 실리카 비드 부피와 보정 중에 사용된 단백질 혼합물의 부피, BSLB 로딩에 사용된 시간 및 온도 사이의 동일한 vol: vol 관계를 유지합니다. 예를 들어, 초기 보정에 0.5 μL의 실리카 비드/웰과 100 μL/웰의 단백질 혼합물이 사용된 경우 BSLB가 T 세포와 공동 배양될 수 있도록 준비하기 위해 5:1,000 vol:vol 비율을 유지합니다.
   12. BSLB에 관심 단백질 혼합물이 로드되면 BSLB를 HBS/HSA(BSA)로 두 번 세척하여 과도한 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. 각 세척 단계에서 RT에서 300 × g의 침 강 속도를 2분 동안 사용하고 상층액을 폐기합니다.
   13. 200μL에서 웰당 5 × 105 BSLB를 재현탁합니다.
   14. 웰당 100μL를 새로운 U-bottom 96웰 플레이트로 옮겨 웰당 BSLB의 최종 양이 2.5 × 10⁵가 되도록 복제합니다.
   15. BSLB를 300×g에서 2분 동안 스핀다운하고 RT하고 상등액을 버립니다.
   16. 100μL의 T 세포 현탁액을 사용하여 BSLB를 재현탁합니다.기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 혼합합니다.
   17. 37 ° C에서 90 분 동안 공동 배양을 배양하십시오 .
       메모: 대안적으로, 세포와 비드는 공동 배양을 위해 Phenol-Red free RPMI 대신 HBS/HSA(BSA) 완충액에 재현탁할 수 있습니다. 이 경우, 중탄산염이 없을 경우 이 가스가 완충액을 빠르게 산성화하므로 non-CO₂ 인큐베이터에서 배양을 수행해야 합니다.
   18. 먼저 RT에서 최소 15분 동안 세포를 배양하여 BSLB-T 세포 공동 배양을 식히십시오. 빛으로부터 보호하십시오.
   19. 500 × g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   20. 차단을 위해 RT 2% BSA-PBS(Ca₂⁺ 및 Mg₂⁺-free)로 세포를 재현탁합니다. 세포를 얼음 위에 45분 동안 놓습니다. 빛으로부터 보호하십시오.
   21. 세포를 배양하는 동안 PBS에서 얼음처럼 차가운 0.22μm 여과 2% BSA를 염색 완충액으로 사용하여 항체 마스터 믹스를 준비하면 추가 차단을 제공할 수 있습니다.
       메모: Brilliant Violet 염료에 접합된 항체의 일부 배치는 BSLB에 비특이적으로 결합하는 경향이 있습니다. 5% BSA-PBS로 차단하면 이러한 소음을 줄이는 데 도움이 됩니다. 이제부터 콜드 체인이 끊어지지 않도록 하십시오.
   22. 500 × g에서 5분 및 4°C 동안 배양을 스핀다운합니다. 상등액을 버리기 전에 백라이트를 사용하여 96웰 플레이트의 바닥을 검사하여 펠릿이 있는지 간단히 확인하십시오.
   23. 멀티채널 피펫을 사용하여 최적화된 항체 농도를 함유한 염색 마스터 믹스의 세포를 재현탁합니다.
       메모: 필터가 없는 피펫 팁을 사용하여 기포 생성 및 염색량 분포 오류를 방지하십시오.
   24. 동형이 표지된 세포 및 BSLB, 형광 및 비형광 BSLB, 단독으로 염색된 세포 및 BSLB를 포함합니다. 모든 대조군(즉, 5 × 10⁵ BSLB/well을 포함하는 BSLB만 및 염색된 이벤트당 항체의 상대적 증가를 방지하기 위해 5 × 10⁵ cells/well을 포함하는 세포 대조군만)에 대해 well당 총 이벤트 수를 준수합니다.
   25. 부피의 절반을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
   26. 얼음처럼 차가운 2% BSA-PBS, pH 7.4 및 500 × g의 침강 단계를 사용하여 세포와 BSLB를 4°C에서 5분 동안 두 번 세척합니다. 세척된 공동 배양을 100μL의 PBS에 재현탁하고 즉시 획득합니다.
   27. 고정이 필요한 경우 PBS에서 0.5% w/v의 PFA를 사용하여 10분 동안 고정하고 한 번 세척한 다음 획득할 때까지 PBS에 보관합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
   28. 보상하기 전에 MESF 표준을 획득하여 가장 어두운 개체군과 가장 밝은 개체군이 모두 선형 측정 범위에 속하도록 합니다.
   29. 보상 샘플을 획득하고, 보상을 계산하고, 보상 행렬(링크)을 실험에 적용합니다.
   30. 각 정량화 채널에 대해 최소 2 × 10⁴개의 총 MESF 표준을 획득하고 저장합니다.
   31. 고처리량 샘플러를 사용한 수집의 경우, 기기 수집을 표준으로 설정하고, 샘플 수집을 80 μL(또는 총 부피의 80%)로 설정하고, 2.0 - 3.0 μL/s 사이의 시료 유속, 50 μL의 시료 혼합 부피(또는 혼합 중 기포 형성을 방지하기 위해 총 부피의 50%), 150 μL/s의 시료 혼합, 3과 5 사이의 우물 당 혼합.
   32. 샘플당 최소 1 × 10⁴개의 단일 BSLB를 획득합니다(참조 게이팅 전략은 그림 3B 패널 (i)-(vi) 참조).
   33. 분석기를 5분 동안 세척하고 세척액을 5분 동안 세척한 후 기기를 끄기 전에 5분 동안 초순수를 세척합니다. HTS를 사용하는 경우 HTS 탭 및 정리 옵션 아래의 옵션을 따르십시오.
   34. FCS 파일을 내보냅니다.

3. BSLB로의 입자 시냅스 전달 측정

1. 실험 FCS 파일을 엽니다. 그림 3B(i)와 같이 측면 및 전방 광 산란 영역(SSC-A 대 FSC-A)을 기준으로 세포 및 BSLB의 모집단을 선택합니다.
2. 연속 수집 창 내에서 이벤트를 선택합니다(그림 3B (ii)).
3. 두 셀과 BSLB의 단일 이벤트에 초점을 맞춥니다. 순차 게이트 FSC-W/FSC-H(singlets-1, 그림 3B 패널(iii)) 및 SSC-W/SSC-H(singlets-2; 그림 3B 패널(iv)). 비례 FSC-A 및 FSC-H가 있는 이벤트를 선택하여 추가 singlets-3 게이트를 정의합니다(그림 3B, 패널(v)).
4. 각 실험 샘플에 대해 MESF 분획 공백 및 1-4 및 단일 세포 및 MESF의 MFI를 추출합니다.
5. 각 분획에서 blank bead population의 MFI를 빼서 MESF fractions 1 - 4에 대한 수정된 MFI(cMFI) 값을 생성합니다.
6. 단일 BSLB 및 셀에 대한 cMFI를 생성합니다(그림 3C 패널(i) 참조).
7. 동형 대조 항체로 염색된 BSLB의 신호를 사용하여 관련 T 세포 마커에 대해 항체로 염색된 BSLB의 MFI를 보정합니다. cMFI를 사용하여 그림 3C 패널(ii)에 표시된 방정식을 사용하여 정규화된 시냅스 전달 비율(NST%)을 계산합니다.
8. 대신 TCR 트리거링에 대한 응답으로 특별히 전달된 입자에 관심이 있는 경우 작용성 BSLB의 MFI에서 null BSLB의 신호를 뺍니다. 이 cMFI를 사용하여 그림 3C 패널 (ii)에 표시된 방정식을 사용하여 TCR 구동 NST%를 계산합니다.
9. T cell-BSLB 인터페이스를 통해 입자 화물로 전달되는 총 분자 수를 결정하는 데 관심이 있는 경우 T cell-BSLB 공동 배양에 대한 동일한 기기 설정 및 획득 세션을 사용하여 MESF 벤치마크 비드를 획득하십시오.
10. MESF 비드 모집단을 분석하고 cMFI를 추출합니다. cMFI에 대한 MESF의 회귀 분석을 위한 최적선의 기울기를 계산합니다.
11. 계산된 기울기를 사용하여 BSLB에 축적된 MESF 수를 추출합니다. isotype 컨트롤 또는 null BSLB를 사용하여 계산된 cMFI를 공백으로 사용하여 BSLB 자극으로 특별히 전송된 MESF 수를 추출합니다.
12. BSLB당 계산된 (평균) MESF를 정량화 항체의 F/P 값으로 나누어 BSLB로 전달된 마커의 분자 수를 계산합니다.

결과

그림 1: APC 표면에 있는 단백질의 절대 정량화. (A) 편도선 B 세포 표면에서 ICAM-1의 정량적 유세포 분석 측정의 예(Foll. Bc) 및 보조 T 세포(TFH)를 사용합니다. (나-VII) 인간 구개 편도선에서 분리된 단일 CXCR5+ Bc 및 TFH를 분석하기 위한 게이팅 전략. 표시된 것은 연속적인 획득 창 내에 포함된 단일 라이브 이벤트를 식별하기 위한 순차적 게이팅 전략입니다. (iii-iv) 검은색 화살표는 이중선을 나타냅니다. (viii) (vii)에 표시된 집단의 관련 이소형(회색 히스토그램, 회색 히스토그램)으로 라벨링된 FMO 대조군(회색 히스토그램)과 비교하여 ICAM...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96 웰 셀 컬트 플레이트 U-바닥(뚜껑 포함), 조직 배양 처리, 비발열성	코스타®	3799	FCM 염색 및 BSLB와 세포의 공동 배양용.
96 웰 셀 컬트 플레이트 V-바닥(뚜껑 포함), 조직 배양 처리, 비발열성.	코스타®	3894	현탁액의 세포 또는 비드의 FCM 염색용.
Alexa Fluor 488 NHS 에스테르 (숙시니미딜 에스테르)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS 에스테르 (숙시니미딜 에스테르)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 및 A20006
Multiwell 6웰 진공 가스 플라즈마로 처리된 조직 배양	송골매	353046	정제된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 배양 및 확장용.
소 우유에서 추출한 카제인, 단백질 키나아제의 기질에 적합(탈인산화 후), 정제 분말
Dynabeads 인간 T-액티베이터 CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
다이나맥-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321디	Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28의 부피가 2 mL 미만인
다이나맥™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301디	Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28의 15 mL 미만 제거
Fetal Bovine Serum Qualified, 원쇼	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	56 oC에서 30분 동안 열 비활성화가 필요합니다
안티 휴먼 CD154 (CD40L), 클론 24-31	바이오레전드	310815 및 310818	Alexa Fluor 488 및 Alexa Fluor 647 콘주게이트(
아르메니아 햄스터 IgG Alexa Fluor 647 아이소타입 제어, 클론 HTK888	바이오레전드	400902	Alexa Fluor 647 NHS 에스테르(Succinimidyl Ester)로 사내에서 라벨링
BD Cytometer 설정 및 추적 비드	벡톤 디킨슨 앤 컴퍼니(BD)	641319	정량적 FCM 이전 기기의 성능 추적