박테리아 유래 항균 화합물의 효과를 평가하기 위한 지연 성장 억제 분석

초록

출처: Moran, J. C. et al., 경쟁에 대한 박테리아 유래 항균제의 효과를 정량화하기 위한 지연 성장 억제 분석. J. Vis. 특급.(2016년)

이 비디오는 한 유형의 박테리아에서 생성된 항균 화합물이 다른 경쟁 박테리아 균주에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 사용되는 지연 성장 억제 분석을 보여줍니다.

프로토콜

다음 방법은 억제제 생성 균주가 있는 경쟁사 균주를 테스트하기 위해 조정됩니다.

참고: 이 프로토콜은 박테리아 배양을 통한 에어로졸 생성을 포함합니다. 이는 현지에서 승인된 안전 고려 사항을 구현하여 밀폐된 공간에서만 수행할 수 있습니다. 레벨 2 안전 캐비닛 내의 한천 플레이트에 배양물을 분무하면 한천 플레이트와 주변 환경의 오염을 최소화할 수 있습니다. 이것은 또한 분무된 박테리아의 에어로졸 흡입으로부터 연구원을 보호할 것이며, 연구원이 격리 레벨 2 유기체를 사용하는 경우 주요 관심사입니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 페트리 접시 주변은 일회용 흡수성 티슈로 가장 잘 덮여 있습니다. UV 광선을 사용한 스프레이 후 오염 제거가 권장됩니다.

1. 한천 접시 준비하기

1. 제조업체의 지침에 따라 뇌 심장 주입(BHI) 한천을 준비합니다.
2. BHI 한천을 121°C, 15psi(제곱인치당 파운드포스)에서 20분 동안 또는 오토클레이브 제조업체의 권장 사항에 따라 멸균합니다.
3. 멸균된 BHI 한천 15ml를 멸균 페트리 접시에 붓고 굳히도록 합니다.
   메모: 분석 내에서 사용되는 모든 한천 플레이트가 동일한 한천 재고에서 유래하고 각 플레이트에 동일한 양의 한천이 있는지 확인하십시오. 이는 사용 가능한 영양소의 변동성과 플레이트 간 억제제 확산을 제한하여 비교를 가능하게 합니다.

2. 멸균 국물 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 BHI 육수를 준비하십시오.
2. 28ml 범용 유리 병에 10ml의 BHI 부분 표본을 추가합니다.
3. BHI 육수를 121 °C, 15psi에서 20분 동안 또는 오토클레이브 제조업체의 권장 사항에 따라 멸균합니다.
   메모: 분석에 사용된 모든 육즙이 결과의 변동을 유발할 수 있는 영양소의 변동을 제한하기 위해 동시에 고압멸균된 동일한 배치의 육즙에서 유래했는지 확인하십시오.

3. 멸균 기화기 병 준비

1. 기화기 병을 분해합니다.
2. 기화기를 통해 5% 표면 활성 세제를 분사하여 내부 오염 물질을 제거하고 기화기 병, 뚜껑 및 기화기를 5% 표면 활성 세제에 밤새 담그십시오.
   메모: 표면 활성 세제를 취급할 때는 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용해야 합니다.
3. 기화기, 뚜껑 및 병을 멸균 공기 흐름 후드 아래에서 건조시킵니다.
4. 병에 70% 에탄올을 채우고 기화기를 다시 부착한 다음 기화기를 통해 일부 에탄올을 분사합니다.
5. 기화기의 뚜껑을 덮고 사용할 때까지 내부에 에탄올을 보관하십시오.
6. 사용 직전에 멸균 BHI 육수로 병을 무균 상태로 헹구고 기화기를 통해 육수를 분사하십시오.
   메모: 이것은 에탄올이 섹션 6.3에서 병에 첨가된 접종물에 영향을 미치는 것을 방지합니다.

4. 세균 하룻밤 배양 준비

1. 멸균 된 BHI 한천 플레이트에 경쟁자와 억제제 균주를 줄무늬를 놓고 약 18 시간 (밤새) 동안 37 ° C에서 호기적으로 배양합니다 .
   메모: 이 플레이트는 4°C에서 보관할 때 같은 주 내에 여러 번 복제하는 데 사용할 수 있는 박테리아 재고를 생성합니다.
2. 10ml의 멸균 BHI 육수에 28ml 범용 병 내에 필요한 경쟁사 박테리아 균주의 단일 콜로니를 접종합니다.
3. 범용 병을 37°C에서 오비탈 셰이커에서 250rpm으로 흔들어 하룻밤 동안 유산소 호흡으로 배양합니다.

5. 억제제 생산 분리물의 스팟 배양

1. 섹션 4에 설명된 대로 하룻밤 배양을 준비합니다.
2. 접종 전에 한천 플레이트가 완전히 건조되고 뚜껑에 결로 현상이 없는지 확인하십시오(예: 37°C에서 60분 동안 플레이트를 배양). 이렇게 하면 접종 부위에서 플레이트를 가로질러 접종물이 퍼지는 것을 방지할 수 있습니다.
3. 피펫 25 μl의 하룻밤 배양을 한천 플레이트의 중앙에 놓습니다. 한천에 배양물을 분사하는 기포를 방지하기 위해 피펫 플런저를 완전히 누르지 마십시오.
4. 배양물의 확산을 제한하기 위해 배양물을 실온에서 건조시키십시오. 37 ° C에서 하룻밤 동안 호기적으로 한천 플레이트를 배양하십시오.

6. 테스트 경쟁자 균주의 스프레이 접종 준비

1. 섹션 4에 설명된 대로 하룻밤 문화를 준비합니다. 하룻밤 배양을 BHI 배지에 10배 희석하여 약 4 x 10⁶ 집락 형성 단위(CFU) ^ml-1 및 OD₆₀₀ 0.3 ±0.05.
   의 현탁액을 생성합니다. 메모: 10 배 희석은 모든 박테리아 종에 대해 4 x 10⁶ CFU ^ml-1을 제공하지 않으며 1 x ^10-1-1 x ^10-6 사이의 연속 희석을 스프레드 도금하여 필요한 희석 계수를 계산합니다.
2. 희석된 배양물을 멸균 플라스틱 향수 기화기 병에 붓습니다.
   메모: 총 부피는 분무되는 한천 플레이트의 수에 필요한 것보다 많아야 합니다. 플레이트당 약 250μl가 직경 9cm의 페트리 접시에 적합합니다.

7. 지연 성장 억제 분석

1. 각 기화기 병을 통해 배양물을 분무하여 한천에 분무하기 전에 배양물이 분무 메커니즘에 적재되었는지 확인합니다.
2. 한천 위 약 15cm 거리에서 약 250μl의 희석 배양액(일반적인 50ml 기화기 3회 분무)을 전체 한천 표면에 분사합니다. 37 ° C에서 하룻밤 동안 호기적으로 한천 플레이트를 배양하십시오. 동일한 스프레이 횟수의 다른 플레이트에 대해 반복합니다.

8. 지연성장 억제 분석 결과 해석

1. 분무된 경쟁사 균주(그림 1A-C, "X"에서 "X")의 성장 억제 영역을 밀리미터 단위로 측정하고, 억제제-생산자의 중심 지점의 직경을 뺍니다(그림 1A-C, "Y"에서 "Y").
   참고: 그림 1E는 이 데이터를 표시하는 방법을 보여줍니다
2. 억제 영역에 대한 선명도 점수를 기록합니다.
   메모: 이것은 관찰된 억제의 정도를 나타냅니다. 예시는 그림 1A-D에 나타나 있으며, 표준화에 사용할 수 있는 균주는 대표적인 결과 섹션에 제안되어 있습니다. 명확성 점수에는 다음 척도를 사용할 수 있습니다: 경쟁자 균주의 성장을 완전히 억제하는 영역을 설명하기 위해 투명도 점수 0. 점수 1은 성장이 거의 완전히 억제되는 영역을 나타내며, 개간 영역에는 개별 군체만 존재합니다. 점수 2는 성장이 감소하는 가시적 영역을 나타내며, 이 영역 내의 성장은 합류하거나 거의 합류하지만 밀도가 >50% 감소합니다. 점수 3은 최소한의 성장 감소만을 나타내고, 성장이 50% 미만으로 합류 및 감소하며, 영역이 여전히 표시되고 측정 가능합니다. 4점은 눈에 띄는 성장 억제가 없음을 나타냅니다. 점수 5는 경쟁사 균주의 성장이 테스트 억제제 생성 균주 근처에서 증가했음을 나타냅니다. 예는 그림 1을 참조하십시오. 이 점수는 실험자에 따라 주관적입니다.

결과

그림 1: 지연 성장 억제 분석법에서 얻을 수 있는 정성적 및 정량적 결과의 범위.성장 억제에 대한 결과는 (A) 완전 억제(점수 0), (B) 부분 억제(점수 1), (C) 부분 억제(점수 2)에서 (D) 억제 없음(점수 4)까지 다양할 수 있습니다. 레이블은 억제제 균주의 성장 가장자리(Y)와 억제 영역의 가장 바깥쪽 가장자리(X)를 나타냅니다. 억제 영역의 크기는 A, B, C 및 D에서 촬영된 플레이트에 대한 측정값을 보여주는 (E)와 같이 0mm에서 10mm 이상까지 다양합니다.최근의 포도상구균 분리물(A

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
뇌 심장 주입 국물	연구실 M	실험실049	풍부한 범용 미디어
한천	머크 밀리포어	101614
페트리 접시	사르슈테트	82.1473.001
플라스틱 향수 기화기	알 수 없음	-	높이 10cm, 뚜껑이 있는 직경 3.5cm의 투명 플라스틱 스프레이 병, 슈퍼마켓 여행 코너에서 구입
보편적인 병		더 이상 생산되지 않음, 대체 SLS BOT5006	28ml 유리 원통형 병(직경 약 280mm, 높이 850mm), 바닥이 평평하고 플라스틱 나사 캡이
12월 90	디콘		표면 활성 세척제

있습니다. 일