감염된 1차 대식세포에서 세포질 및 진공 살모넬라균을 정량화하기 위한 분석

초록

출처: Meunier, E., et al. Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization(차등 투과에 의한 1차 대식세포에서 세포질 대 Vacuolar Salmonella의 정량화). J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 차등 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포 내부의 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포는 형광 단백질을 발현하는 살모넬라균(Salmonella)에 감염되어 있으며, 이 물질은 살모넬라균 함유 액포 또는 SCV라고 하는 특수 액포 구조 내부에 내재되어 있습니다. 박테리아의 하위 집합은 SCV를 탈출하여 세포질로 들어갑니다. 콜레스테롤이 풍부한 대식세포의 원형질막은 디지토닌(digitonin)을 사용하여 투과화되어 SCV는 손상되지 않습니다. 세포질 박테리아를 형광 표지 항체로 라벨링하면 액포 및 세포질 박테리아의 비율이 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 정량화됩니다.

프로토콜

1. mCherry 발현 살모넬라균을 이용한 디지토닌 분석(FACS 기반 분석)

1. 박테리아 준비
   참고: 이 분석에는 플라스미드(rpsM 프로모터에서 mCherry를 인코딩하는 pFPV)에서 mCherry를 발현하는 살모넬라 야생형 SL1344(스트렙토마이신 내성)가 사용됩니다. 박테리아 식세포작용 및 증식은 mCherry의 구성적 발현에 의해 변경되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음).
   1. 감염 1일 전에 스트렙토마이신(90μg/ml) 및 암피실린(100μg/ml, mCherry 발현 벡터)이 보충된 3ml의 LB 배지에 37°C O/N의 셰이커에 균주를 접종합니다.
2. 감염을 위한 도금 세포.
   1. 1 ml 의 1 차 대식 세포 배지 (10 % 태아 송아지 혈청 (FCS, 열 불활성화, 56 ° C, 30 분), 1 % 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1 % Non-essential amino acids (NEAA), 1 % L-Glutamine 및 10 % L929 상등액 (L929 세포를 생산하는 대식 세포 집락 자극 인자 (M-CSF)의 조건 배지)의 1.25 x 10⁵ 세포 / 웰의 밀도로 24 웰 플레이트에 야생형 BMDM을 종종합니다. 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 고려합니다. 대조군으로 사용되는 우물에 커버슬립을 추가합니다(표 1).
   2. 37°C 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.
3. 박테리아가 감염될 수 있도록 준비시킵니다.
   1. 다음 날, 배양액을 인산염 완충 식염수(PBS)에서 1:10으로 희석하고 PBS 단독 대조군과 대조하여 OD₆₀₀을 측정하여 야간 배양에서 살모넬라균의 농도를 측정합니다. 이를 통해 OD₆₀₀이 분광 광도계의 선형 범위에서 측정됩니다.
   2. ml당 살모넬라균의 농도를 계산합니다. OD₆₀₀ 1은 1 x 10⁹ 박테리아에 해당합니다.
   3. 대식세포 배지에서 박테리아를 희석하여 1.25 x 10⁶ cells/ml의 살모넬라 농도에 도달합니다.
4. 살모넬라균에 의한 세포 감염.
   1. BMDM에서 배지를 제거합니다. 감염되지 않은 대조군 웰(B1-B3, C1-C3)에 대식세포 배지 1ml를 추가합니다. Salmonella 현탁액 1ml를 웰 A1 - A5에 추가하여 세포당 10개 박테리아의 다중 감염성(m.o.i.)에 도달합니다.
   2. 37°C에서 300 x g로 15분 동안 플레이트를 원심분리하여 감염을 동기화합니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂의 인큐베이터로 옮깁니다.
5. 겐타마이신으로 세포외 살모넬라균을 죽이기.
   1. 감염 후 1시간이 지나면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 0.1mg/ml 겐타마이신이 포함된 0.1ml의 대식세포 배지를 추가하여 세포외 박테리아를 죽입니다. 감염되지 않은 대조군을 포함한 모든 웰에 겐타마이신을 첨가하여 모든 세포가 동일한 방식으로 처리되도록 합니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂의 인큐베이터로 옮깁니다.
6. 세포를 씻습니다.
   1. 감염 후 2시간이 지나면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 모든 웰을 1ml의 일반 DMEM(37°C로 예열)으로 2x 세척하고 10μg/ml 겐타마이신을 함유한 대식세포 배지(37°C로 예열)로 교체하여 남아 있는 세포외 박테리아의 성장을 방지합니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂의 인큐베이터로 옮깁니다.
7. 세제와 항체로 새로운 완충액을 준비합니다.
   1. 원하는 분석 시점 직전에 KHM 완충액(110mM 칼륨 아세테이트, 20mM HEPES, 2mM MgCl₂, pH 7.3)에 1mg/ml의 디지토닌의 신선한 원액을 준비합니다. 스톡을 여과하고 KHM 완충액에서 50μg/ml의 디지토닌 작업 농도로 희석합니다. 또한, 3% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 KHM 완충액에 0.1% 사포닌, 1/500에 플루오레세인 이소티오시아네이트(CSA-1-FITC)와 결합된 항살모넬라균, 1/100에 항단백질이황화이소머라제(anti-PDI)
   용액을 준비합니다.
8. 세포 투과화.
   1. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 0.5ml의 KHM 버퍼(37°C로 예열)로 웰을 3번 세척합니다. KHM 버퍼를 제거하고 웰 A4 및 B1/C1에 0.25ml 플레인 KHM 버퍼를 추가하고, 웰 A1 - A3 및 B2/C에 디지토닌이 포함된 KHM 버퍼를 첨가하거나 웰 A5 및 B3/C3에 사포닌이 포함된 KHM 버퍼를 추가합니다(표 1 참조). RT에서 정확히 1분 동안 배양하고 즉시 0.5ml의 KHM 버퍼(37°C로 예열)로 모든 웰을 3번 세척합니다.
9. 1차 항체 염색.
   1. KHM 완충액을 제거하고 1차 항체 용액(Goat anti-Salmonella-FITC, 250 μl/well, 0.1 μg/ml)을 적절한 웰에 추가합니다(그림 1, 표 1). 37 ° C 및 5 % CO₂의 인큐베이터에서 15 분 동안 플레이트를 배양합니다.
   2. 1mL PBS로 세포를 1x 세척합니다.
10. 감염된 세포(웰 A1 - A5): FACS 분석
    1. PBS로 세포를 3x 세척하고 0.1% 트리톤을 함유한 얼음처럼 차가운 PBS 0.5mL를 추가합니다. 세포 여과기 캡이 있는 5mL FACS 튜브로 옮겨 세포 응집체를 분해합니다. 얼음 위에 샘플을 보관하십시오.
    2. FACS의 샘플을 분석합니다. 완전 투과형 컨트롤을 사용하여 먼저 전방 및 측면 산란(FSC/SSC)을 기반으로 총 박테리아에 대한 게이트를 설정하고 mCherry 신호(610nm ± 20nm 필터)를 설정합니다.
    3. 다음으로, 완전 투과성 및 비투과성 대조군을 사용하여 전체 박테리아 집단의 FITC 신호를 분석하여 세포질 박테리아(FITC+, mCherry+) 및 액포 박테리아(FITC-, mCherry+)에 대한 게이트를 설정합니다(그림 2).
    4. 게이트를 설정한 상태에서 샘플을 분석하고 제조업체의 프로토콜에 따라 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 세포질 박테리아 대 액포 박테리아의 비율을 결정합니다.

표 1: 살모넬라균 후속 감염, 투과화 및 염색을 위한 24웰 형식의 골수 유래 대식세포(BMDM)에 대한 도금 계획.

		투과화		염색
	유리 커버슬립	살모넬라균	디지토닌	사포닌	안티 살모넬라균	안티 칼넥신	PDI 방지
A1 (샘플)	-/+*	+	+		+
A2 (샘플)	-/+*	+	+		+
A3 (샘플)	-/+*	+	+		+
A4 (투과성 제어 없음)	-/+*	+			+
A5 (완전 투과화 제어)	-/+*	+		+	+
B1 (칼넥신에 대해 염색)	+					+
B2 (칼넥신에 대해 염색)	+		+			+
B3 (칼넥신으로 염색)	+			+		+
C1(PDI용으로 염색됨)	+						+
C2(PDI용으로 염색됨)	+		+				+
C3(PDI용으로 염색됨)	+			+			+

결과

그림 1. 프로토콜 1의 개략적 표현. 온전한 액포 또는 세포질에 mCherry 양성 살모넬라균을 포함하는 감염된 세포는 디지토닌으로 차등적으로 투과됩니다. 세포질 살모넬라균은 FITC와 결합된 항살모넬라균으로 염색됩니다. FACS 분석을 위해 Triton X-100으로 세포를 세척 및 용해합니다. 음성 대조군 세포는 투과화되지 않는 반면, 양성 대조 세포는 항체 염색 전에 완전히 투과화됩니다.

그림 2. 6시간 동안 mCherr...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
디지토닌	시그마	D5628	50ug/mL
PFA는	엠피비오	219998380
헤페스	생명 기술	15630
칼륨 아세테이트	시그마	791733
재질 보기 MgCl2	시그마	M8266
증권 시세	시그마	A2153
항살모넬라균 CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
항살모넬라균 CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
안티 칼넥신	엔조 라이프사이언스	온천-860D	1/100
PDI 방지	엔조 라이프사이언스	스파-890	1/100
사포닌	시그마	47036
Vectashield 장착 매체	벡터랩	H-1200
토끼 항체-488	분자 프로브	A-11070	1/500
겐타마이신	생명 기술	15710-49	100ug/mL 및 10ug/mL
트리톤 X-100	프로메가	H5141
PBS (PBS)	지브코	20012-019
DMEM을 참조하십시오.	시그마	D6429
네아	아미메드	5-13K00-시간
FACS 포르테사	BD 기술		검출 mCherry 610nm
FACS 포르테사	BD 기술		검출 FITC 530 nm

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