인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 인간 혈액 채취 및 세척된 혈소판 분리를 위한 완충액 준비
- 1.4g의 구연산 일 수화물 (C6H8O7 • H2O, 66.6 mM), 2.5g의 구연산 삼 수화 물 (Na3C6H5O7 • 2 H2O, 85 mM) 및 무수 D (+) -포도당 2g을 용해하여 산-구연산 포도당 (ACD) 100mL 수용액을 준비합니다. 용액의 pH는 약 4.5입니다.
- 다음과 같이 Tyrode의 완충액을 위한 저장 용액을 준비합니다
- 80g의 염화나트륨(NaCl), 2g의 염화칼륨(KCl), 10g의 중탄산나트륨(NaHCO3) 및 0.58g의 인산이수소나트륨(NaH2PO4*H2O)을 증류된 H2O 500mL에 용해시켜 원액 1을 준비합니다. 각각의 최종 농도는 2.73m, 53.6mM, 238mM 및 8.4mM입니다. 용액을 4°C로 유지하십시오.
- 10.15g의 마그네슘 이염화물 육수화물(MgCl2*6 H2O)(100 mM)을 500 mL 증류수(H2O)에 용해시켜 원액 2를 준비합니다. 용액을 4°C로 유지하십시오.
- 10.95g(100mM) 염화칼슘 육수화물 CaCl2*6 H2O를 500mL 증류 H2O에 용해하여 원액 3을 준비합니다. 용액을 4°C로 유지합니다.
- 최종 부피 50mL에 2.5mL의 원액 1을 증류된 H2O로 희석하여 Tyrode의 완충액을 준비합니다. 이는 136.5 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 11.9 mM NaHCO3 및 0.42 mM NaH2PO4*H2O의 최종 농도에 해당합니다. pH를 7.35로 조정하고 0.22μm 필터로 여과하여 살균합니다.
- 5mL의 원액 1, 원액 2 1mL, 원액 3 2mL, 1M HEPES 0.5mL, 200g/L 인간 혈청 알부민 1.8mL 및 무수 D(+)-글루코스 0.1g을 100mL 증류된 H2O의 최종 부피로 희석하여 Tyrode의 알부민 0.35% 완충액(TA 완충액)을 준비합니다.
- 1N 염산(HCl)으로 pH를 7.35로 조정하고 증류된 H2O(총 부피의 10%)를 첨가하여 삼투압을 295mOsm/L로 설정합니다. 이 용액의 최종 농도는 124 mM NaCl, 2.44 mM KCl, 10.82 mM NaHCO3, 0.38 mM NaH2PO4 * H2O, 0.91 mM MgCl2 * 6 H2O, 1.82 mM CaCl2 * 6 H2O입니다. 전체 실험 동안 TA 버퍼를 37 ° C로 유지하십시오.
2. 혈액 채취
- 19G 바늘과 지혈대가 없거나 낮은 것을 사용하여 후두부 정맥에서 45-50mL의 정맥 혈액을 ACD 항응고제(혈액 6부피에 대해 1부피 ACD)가 포함된 50mL 튜브에 수집합니다. 트롬빈과 조직 인자의 존재를 피하기 위해 처음 1-2mL의 혈액을 버리십시오.
- 채취 후에는 튜브를 부드럽게 거꾸로 하여 혈액을 ACD와 혼합합니다. 샘플을 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
3. 인간 세척 혈소판의 준비
- 원심분리기를 37°C로 예열합니다. 아래의 모든 원심분리 단계는 이 온도에서 수행됩니다.
- 수집된 혈액을 15mL 튜브(튜브당 5mL)에 넣고 250 x g에서 13분 동안 원심분리하여 혈소판이 풍부한 혈장, PRP를 얻습니다.
메모: 이 원심분리 단계는 샘플에서 3개의 층을 생성합니다: 1) 상층은 혈장, 혈소판 및 백혈구의 작은 부분으로 구성됩니다. 2) 중간층, 백혈구가 풍부한 부분. 3) 본질적으로 적혈구로 구성된 바닥층.
- 적혈구 및 백혈구의 오염을 최대한 방지하기 위해 새로운 15mL 튜브에 상층을 조심스럽게 피펫팅하여 PRP를 수집하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 2,200 x g에서 12분 동안 PRP를 원심분리(5mL PRP의 경우).
메모: 이 원심분리 단계는 브레이크가 낮거나 브레이크 없이 수행되어야 합니다.
- 상층액(혈소판 부족 혈장)을 제거하고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 2μL/mL의 헤파린(5,000 U/mL)과 2.5μL/mL의 25μM 프로스타사이클린(PGI2)을 포함하는 10mL의 TA 완충액으로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.
- 2.5 μL/mL의 25 μM 프로스타사이클린-I2(PGI2)를 추가하고 1,900 x g(낮은 브레이크 또는 브레이크 없음)에서 8분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 2.5μL/mL의 25μM PGI2를 함유한 5mL TA 버퍼로 펠릿을 재현탁합니다. 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.
- 배양 기간 동안 혈소판 현탁액 150μL를 1.5mL 튜브에 피펫팅하고 자동 세포 계수기(직류 저항의 변화를 측정하여 혈액 세포의 크기를 감지)를 사용하여 혈소판 계수를 계산합니다.
- 10분 배양 후 2.5μL/mL의 25μM PGI2를 혈소판 현탁액에 첨가하고 즉시 1,900 x g에서 8분 동안 원심분리합니다.
- 상등액을 제거하고 0.01 U/mL(최종 농도 0.32 U/mL)에서 32 μL/mL의 아피라아제를 포함하는 적절한 부피의 TA 완충액(즉, 세포 수가 μL당 500,000인 경우 10mL TA 완충액에 재현탁)을 사용하여 펠릿을 250,000 혈소판/μL 농도로 재현탁합니다
메모: 고농도의 아피라제는 작용제가 없는 상태에서 아데노신 삼인산(ATP)의 자발적 분비에 의해 유도되는 P2X 퓨리노수용체 1, P2X1 수용체의 탈감작을 피하기 위해 사용됩니다. 이는 콜라겐 유도 반응이 활성화된 혈소판에서 방출된 ATP에 의한 P2X1의 빠른 부분비/자가분비 활성화에 의해 유도되기 때문에 중요합니다. 혈소판 신호전달 경로가 P2X1 기능의 보존을 심각하게 필요로 하지 않는 경우 0.02 U/mL 아피라제를 사용합니다. 여러 연구에서 0.02 U/mL 아피라제는 아데노신 이인산 ADP 수용체 P2Y 퓨리노수용체 1 및 P2X1 반응이 무시할 수 있는 P2Y1 탈감작을 피하는 것으로 나타났습니다.
- 응집적 측정을 수행하기 전에 37°C에서 최소 30분 동안 세포 현탁액을 배양합니다. 제제는 5-8 시간 동안 안정적입니다.
4. 응집법
- Tyrode의 완충액에 피브리노겐(56mg/mL)을 준비합니다.
- 10μL의 피브리노겐(56mg/mL)과 자기 교반 막대를 포함하는 유리 큐벳(그림 1A, 왼쪽 큐벳)에 260μL의 혈소판 현탁액을 피펫 주입한 다음 응집체에 존재하는 배양 웰에서 37°C에서 2 - 3분 동안 현탁액을 배양합니다(그림 1B 및 1C).
- 37°C에서 7분 동안 10μL의 2.8mM 또는 28mM 원액(최종 농도 각각 100μM 및 1mM)을 추가하여 Panx1 억제제 Brilliant Blue FCF로 사전 배양합니다.
- 10μL 피브리노겐(56mg/mL), 10μL Brilliant Blue FCF(2.8mM 또는 28mM) 및 혈소판이 없는 TA 완충액을 포함하는 큐벳의 광학 밀도(OD)를 측정하여 집그레모미터를 가정적인 100% 응집 값으로 보정합니다.
- 자동 교반 아래의 응집 웰에 큐벳을 놓고 응집계에 연결된 컴퓨터의 키보드에서 해당 버튼을 누릅니다(즉, 응집 웰 1이 사용되는 경우 F1 누름).
메모: 아래에 설명된 이 실험에는 Brilliant Blue FCF가 포함됩니다. 보정에 사용되는 화합물은 실험 조건에 맞게 조정해야 합니다.
- 자동 교반 하에 실험에 사용될 동일한 혈소판 샘플을 사용하여 응집체를 가정적인 0% 응집 값으로 보정합니다.
- 큐벳을 응집체에 놓고 응집계에 연결된 컴퓨터의 키보드에서 해당 버튼을 누릅니다. 계속하기 전에 약 20-30초 동안 기다리십시오. 이 지연은 agonists를 추가하기 전에 집계가 발생하지 않도록 하는 역할을 합니다.
메모: 혈소판 수의 차이는 측정된 OD에 영향을 미칠 수 있으므로 각 개별 측정에 대해 0% 보정 단계를 반복해야 합니다.
- 15μg/mL 콜라겐(1μg/mL 최종) 또는 1.125mM 아라키돈산(75μM 최종)과 같은 원하는 작용제 20μL를 큐벳에 추가합니다. 즉시 aggregometer.
에 연결된 컴퓨터의 키보드에서 해당 버튼을 눌러 연속 자동 교반 상태에서 녹음을 시작합니다.
메모: 작용제의 추가는 혈소판 활성화를 유도합니다. 혈소판 응집체는 실험이 끝날 때 유리 큐벳에서 명확하게 구별할 수 있습니다(그림 1A, 오른쪽 큐벳).
- 녹음은 6분 후에 자동으로 중지됩니다. 이 시점에서 컴퓨터의 저장 아이콘을 클릭하여 데이터를 저장합니다.
메모: 집계 속도의 계산은 컴퓨터에 의해 수행되며, 컴퓨터는 집계 프로세스의 최종 결과를 백분율로 표현합니다.
