CXCR4 상호 작용 제제의 식별을 위한 세포 분석

초록

출처: Claes, S. et al., G 단백질 결합 수용체 작용제, 길항제 및 알로스테릭 조절제를 식별하기 위한 운동 형광 기반 Ca²⁺ 동원 분석.J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 CXCR4 케모카인 수용체를 발현하는 교모세포종 세포와 관련된 세포 분석을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 염료를 사용하여 제제 상호 작용에 따른 형광 변화를 측정하여 세포 신호 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

참고: 섹션 1 및 2에 설명된 모든 단계는 층류 캐비닛의 멸균 조건에서 수행됩니다.

1. U87 유지 보수. CD4.hCXCR4 세포

1. 가습 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO₂의 T75 배양 플라스크에서 세포를 성장시킵니다.
   메모: 본 프로토콜에 사용된 in vitro 세포주는 CD4(cluster of differentiation 4) 및 인간 CXC chemokine receptor 4(CXCR4)를 안정적으로 발현하는 U87 교모세포종 세포주이며, 이전에 기술된 바 있습니다. CD4 및 CXCR4의 세포 표면 발현은 유세포 분석에 의해 지속적으로 모니터링되며 발현 수준은 시간이 지남에 따라 일정하게 유지됩니다(~ 100% CD4⁺ 및 ~ 100% CXCR4⁺ 세포). 사용된 세포주의 생성 및 수용체 발현 수준을 조사하기 위한 유세포 분석 절차에 대한 자세한 설명은 이 프로토콜의 범위에 속하지 않습니다.
   1. 80-85% 농도에서 세포를 계대배양합니다. 세포 배양 전에 모든 시약이 실온(RT)에 도달하도록 합니다.
   2. 세포에서 컨디셔닝된 배양 배지를 제거하고 세포 단층을 5mL 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척합니다.
   3. 0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(트립신-EDTA) 3mL를 첨가하고 세포 단층에 고르게 분포시킵니다. 그런 다음 과도한 트립신-EDTA를 제거하고 세포가 분리되기 시작할 때까지 37°C에서 최대 5분 동안 배양합니다.
   4. 10mL의 신선한 완전 성장 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 0.01M 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) + 적절한 선택제)를 추가합니다. 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 멸균된 50mL 튜브로 옮깁니다.
   5. 선택한 방법을 사용하여 실행 가능한 세포의 수를 계산합니다. U87 교모세포종 세포의 경우 생존율은 일반적으로 ~ 100%.
      에 이릅니다. 메모: 세포 번호는 여러 가지 방법으로 확인할 수 있습니다. 당사는 표준 취급 절차에 따라 트리판 블루 염색(재료 표 참조)을 기반으로 하는 자동 세포 분석 시스템을 일상적으로 사용하지만, 다른 방법도 마찬가지로 잘 작동해야 합니다.
   6. T75 배양 플라스크에서 25mL 신선 성장 배지의 최종 부피에 2 x 10⁶ 또는 3 x 10⁶(생존 가능) 세포를 추가하고 37°C 및 5% 이산화탄소(CO₂)에서 배양합니다.
      메모: 3 x 10⁶ 개의 세포를 사용하면 세포는 2 일 후에 80-90 % 포화도에 도달합니다. 2 x 10⁶ 셀을 사용하면 3일 후에 동일한 농도에 도달합니다. 세포의 성장 속도는 다른 세포주를 사용하는 경우 먼저 경험적으로 결정해야 합니다.

2. Ca²⁺ 동원 분석을 위한 세포 시딩

1. 세포 통과 당일(0일차)에 투명한 바닥이 있는 검은색 벽 폴리스티렌 96웰 플레이트(재료 표 참조)를 세포 부착을 용이하게 하기 위해 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅합니다.
   메모: 96웰 플레이트를 젤라틴으로 코팅하는 것은 상업적으로 이용 가능한 사전 코팅된 플레이트(재료 표 참조)를 사용하는 경우 생략될 수 있습니다. 프로토콜을 진행하기 전에 연구 중인 각 세포주에 대해 수동 코팅 대신 사전 코팅된 플레이트의 사용을 평가하는 것이 좋습니다.
   1. 100mL PBS에 젤라틴 1g을 첨가하여 1% 용액을 얻어 젤라틴 용액을 준비합니다. 더 사용하기 전에 PBS로 10배 희석하십시오. 젤라틴의 용해도를 높이려면 용액을 37 °C로 가열하십시오.
   2. 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 웰당 0.1% 젤라틴 용액 100μL를 추가합니다. RT에서 2시간 동안 배양합니다.
2. 그 동안, 코팅된 96웰 플레이트에서 파스딩할 세포를 준비합니다.
   1. 배양 플라스크에서 세포를 분리하고 신선한 성장 배지에 재현탁시킨 다음 트리판 블루 염색 방법을 사용하여 계수합니다.
   2. 50mL 튜브의 세포를 RT에서 400 x g으로 5분 동안 스핀다운합니다.
   3. 세포를 새로운 성장 배지(DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, 항생제 없음)에 재현탁하여 0.1 x 10⁶ (생존 가능) cells/mL의 세포 밀도를 얻습니다.
3. 바닥이 투명한 검은색 벽의 접시에서 젤라틴 용액을 접시를 뒤집어 티슈에서 건조시켜 제거합니다. 200μL/웰 PBS를 추가하여 과도한 젤라틴을 제거하고 플레이트를 다시 뒤집습니다.
4. 젤라틴으로 코팅된 96-웰 플레이트(지금부터 이 플레이트는 "측정 플레이트"라고 함)에 웰당 200μL의 셀 현탁액(0.2 x 10⁵ 셀에 해당)을 분배합니다.
5. 37 ° C와 5 % 이산화탄소 (CO₂)에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

3. 형광 Ca²⁺ - 과민한 염료로 세포의 적재

1. 1일차에 형광 Ca²⁺ 결합 염료 fluo-2 acetoxymethyl(fluo-2 AM)을 seeded cell에 로드하는 것으로 시작하여 실제 Ca²⁺ 동원 분석을 수행합니다.
   1. 200mL Hank's Balanced Salt Solution(HBSS, 10x, 페놀 레드 없음, 중탄산나트륨 없음)에 40mL HEPES(1M)를 첨가하여 분석 완충액을 준비합니다. 초순수를 첨가하여 최종 부피 2L를 얻고 소 혈청 알부민(BSA) 4g을 첨가합니다. 자기 교반을 통해 BSA를 용해시킵니다. pH를 7.4(수산화나트륨, NaOH 포함)로 조정하고 용액을 여과합니다.
      메모: 다음의 모든 단계에서 "분석 버퍼"라고 하는 동일한 버퍼가 사용됩니다.
   2. 형광 Ca²⁺-민감 염료 fluo-2 AM의 원액(4mM in dimethyl sulfoxide(DMSO))을 준비합니다. 빛에 대한 과도한 노출을 피하십시오. 1 mg fluo-2 AM (분자량 : 1,061 g / mol)을 235.6 μL DMSO에 용해시킵니다.
   3. fluo-2 AM의 작업 용액을 준비합니다. 하나의 96웰 분석 플레이트의 경우 12.5μL의 fluo-2 AM 원액(4mM)과 12.5μL 비이온성 계면활성제 폴리올(예: pluronic f-127) 용액(DMSO의 20% 중량/부피, 재료 표 참조)을 혼합합니다. 이 혼합물 22μL를 15mL 튜브의 11mL 분석 버퍼에 추가합니다. fluo-2 AM의 최종 농도는 4μM입니다.
      메모: 비이온성 계면활성제는 fluo-2 AM의 수성 용해도를 개선하고 결과적으로 세포 로딩을 향상시키기 위한 분산제로 사용됩니다. DMSO에서 계면활성제를 가용화하려면 시료를 37°C에서 가열하고 정기적으로 혼합하여 균일한 용액을 얻습니다.
   4. 96-well 측정 플레이트에서 이전에 파종된 세포에서 성장 배지를 플레이트를 뒤집어 종이 타월로 건조시켜 제거합니다.
   5. 멀티채널 피펫을 사용하여 웰당 100μL의 loading dye solution을 추가하고 어두운 곳에서 RT에서 45분 동안 배양합니다.

4. 케모카인 리간드 CXC 케모카인 리간드 12(CXCL12) 또는 조사 중인 화합물을 포함하는 96웰 폴리프로필렌 플레이트의 제조

1. 둥근 바닥 폴리프로필렌(PP) 96웰 플레이트를 구합니다(재료 표 참조).
   1. CXCL12의 원액(1mg/mL)과 조사 중인 화합물의 원액이 RT에서 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
      메모: CXCL12의 원액은 0.01% Tween20이 보충된 초순수에서 제조되고 일회용 분취액으로 -20°C에서 보관됩니다.
   2. 분석 완충액(250ng/mL, 31.25nM과 동일)에 CXCL12의 5배 농축 용액을 준비하고 각 화합물의 5배 농축 희석액(분석 완충액)을 준비합니다.
   3. 사전 정의된 플레이트 레이아웃에 따라 원액을 적절한 96웰 플레이트에 분배합니다. CXCL12가 포함된 플레이트("chemokine 플레이트")에 75μL/well을 분주하고 화합물이 포함된 플레이트("compound plate")에 50μL/well을 분주합니다.
      메모: 화합물과 CXCL12 모두 측정 플레이트에 분배할 때 최종적으로 5배 희석됩니다. 또한 분석 완충액만 포함하는 negative control well을 compound plate와 chemokine plate 모두에 포함하는 것이 중요합니다. 또한 positive control well이 포함되어야 합니다(즉, chemokine 플레이트에 CXCL12가 있는 well, 그러나 compound plate의 해당 well에 분석 버퍼가 있음).

5. 형광 마이크로플레이트 리더의 프로토콜 설정

참고: 이 프로토콜에 사용된 형광 마이크로플레이트 리더는 Table of Materials에서 참조됩니다.

1. 먼저 형광판 리더의 냉각기를 켠 다음 형광 리더 자체를 켭니다. 몇 분 동안 시작하고 시스템 소프트웨어를 엽니다.
2. 다음 단계를 포함하는 drag-and-drop 메뉴를 사용하여 분석의 프로토콜을 생성합니다.
   1. "설정" 상자에서 여기 파장: 470-495 nM, 방출 파장: 515-575 nM인 'Read_Mode'를 선택합니다.
      메모: 선택한 파장은 Ca²⁺-sensitive dye fluo2와 함께 사용하기에 적합합니다.
   2. 장치의 소스 2 위치에 놓일 컴파운드 플레이트의 화합물을 자동으로 혼합하기 위해 "TF와 혼합"(전달 유체) 상자를 포함합니다(6.4단계 참조). 각 웰에서 15μL의 용액을 선택하여 자동으로 흡인하고 3회 혼합합니다. 피펫 팁의 높이를 액체 표면에서 20μL 아래로 조정합니다. 흡입 및 분주 속도를 50μL/s로 설정합니다.
      메모: 피펫 팁의 높이는 피펫 팁 아래에 남아 있는 부피를 나타냅니다. 예를 들어, 복합 플레이트의 웰에 50μL가 포함된 경우 30μL의 높이는 액체 표면 아래 20μL에 해당합니다. 혼합에 필요한 복합 용액의 부피, 혼합 속도, 혼합 중 피펫 팁의 위치 및 혼합 주기 수는 모두 소프트웨어를 사용하여 조정할 수 있습니다.
   3. "Transfer Fluid" 상자에서 화합물 플레이트의 각 웰 20μL가 측정 플레이트로 전달되도록 정의합니다. 피펫 팁을 액체 표면에서 20 μL 아래, 즉 화합물을 흡인하는 동안 30 μL의 높이에, 측정 플레이트에 분주하는 동안 60 μL의 높이에 배치합니다. 흡입 속도를 50 μL/s로 설정하고 분주 속도를 25 μL/s로 설정합니다.
      메모: 화합물 플레이트에는 웰당 50μL의 용액이 포함되어 있으므로(단계 4.1.3 참조) 30μL의 높이는 액체 표면 아래 20μL의 위치에 해당합니다. 측정 플레이트에는 웰당 80μL의 분석 버퍼가 포함되므로(단계 6.3 참조) 60μL의 높이는 팁의 유사한 위치에 해당합니다.
   4. "TF로 읽기" 버튼을 선택합니다. 첫 번째 간격 동안 판독 간격 시간이 60초인 1개의 판독(형광 측정)을 선택합니다. 화합물을 측정 플레이트에 분주하기 전에 10번의 판독이 기록되고 그 후에 50번의 판독이 기록된다고 정의합니다. 읽기 간격 시간이 30초이고 읽기가 18회인 두 번째 간격을 정의합니다.
      메모: 이 단계에서 형광은 총 ~ 10분 동안 운동학적으로(정의된 시간 간격으로) 측정됩니다.
   5. 프로토콜에 "Wash Tips" 버튼을 세 번 포함합니다. 각 세척 단계 내에서 유체 유형: 유체 A(초순수) 또는 유체 B(70% 에탄올), 세척 횟수(1), 펌프 속도(빠름) 및 각 세척 단계 중 스트로크 수(5)를 선택합니다.
      메모: 첫 번째 및 마지막 세척 단계에서는 유체 A가 사용되고, 두 번째 세척 단계에서는 유체 B가 사용됩니다.
   6. "Pause Pipettor" 기능을 포함합니다. 피펫터를 300초 동안 일시 중지하도록 설정합니다.
      메모: 프로토콜에 이 단계를 포함하면 형광판 리더 장치에 통합된 피펫터 헤드가 프로토콜을 계속하기 전에 5분 동안 일시 중지됩니다.
   7. 장치의 소스 3 위치에 위치할 케모카인 플레이트에서 CXCL12 용액을 자동으로 혼합할 수 있도록 "TF와 혼합" 상자를 포함합니다(6.4단계 참조). 각 웰에서 15μL의 용액을 선택하여 자동으로 흡인하고 3회 혼합합니다. 흡입 및 혼합 중에 피펫 팁을 액체 표면에서 20μL 아래에 놓습니다. 흡입 및 디스펜싱 속도는 50μL/s로 설정됩니다.
      메모: 5.2.2단계와 유사하게 이러한 매개변수를 조정할 수 있습니다.
   8. 다음 "Transfer Fluid" 상자에서 케모카인 플레이트의 각 웰에서 25μL가 측정 플레이트로 전달되도록 정의합니다. 팁 위치 결정 20 μL 액체 표면, 즉 75 μL/well을 포함하는 케모카인 플레이트에서 흡입하는 동안 55 μL 높이에서(단계 4.1.3 참조), 측정 플레이트에서 분배하는 동안 80 μL 높이에서. 흡입 속도를 50 μL/s로 설정하고 디스펜싱 속도를 25 μL/s로 설정합니다.
   9. "TF로 읽기" 버튼을 포함합니다. 첫 번째 간격 동안 읽기 간격 시간이 1초인 145개의 읽기를 선택합니다. CXCL12를 측정 플레이트에 분배하기 전에 5개의 판독이 기록되고 그 후에 140개의 판독이 기록된다고 정의합니다. 읽기 간격 시간이 6초인 두 번째 간격을 정의하고 20 reads.
      를 선택합니다. 메모: 종합하면, 전체 프로토콜에 걸쳐 243개의 판독(형광 측정)이 기록됩니다: 5.2.4 단계에서 78개, 5.2.9 단계에서 165개.
   10. 5.2.5단계와 유사하게 프로토콜에 "세척 팁" 버튼을 세 번 포함합니다.
       메모: 프로토콜 끝에 이 단계를 포함하면 팁을 변경할 필요 없이 다른 분석을 수행하는 데 팁을 재사용할 수 있습니다.
3. "Set stage temperature" 버튼을 클릭하고 37°C를 선택하여 장치의 온도를 37°C로 설정합니다.

6. 형광 분석 실행

1. 측정 플레이트를 로딩 버퍼와 함께 45분 동안 배양한 후(3.1.5단계 참조) 플레이트를 뒤집어 버퍼를 제거하고 티슈에서 건조시킵니다.
2. 150 μL/well의 분석 완충액을 첨가하여 파종된 세포를 세척하고 2분 동안 배양합니다.
3. 플레이트를 뒤집어 버퍼를 다시 제거합니다. 멀티채널 피펫으로 80μL/well의 분석 버퍼를 추가합니다.
4. 모든 플레이트를 장치의 적절한 위치, 즉 소스 2 위치의 복합 플레이트, 소스 3 위치의 케모카인 플레이트, 판독 위치의 측정 플레이트에 넣습니다. 소스 1 팁 위치에 검은색 팁 상자를 놓습니다. 프로토콜을 계속하기 전에 장치의 도어를 닫고 5분 동안 배양합니다.
5. "프로토콜 신호 테스트" 버튼을 선택하여 플레이트에 대한 배경 상대 조명 단위(RLU)와 형광 변화를 확인합니다. 새 창이 나타납니다. "테스트 신호"를 선택합니다.
   메모: 이 단계에서 백그라운드 RLU는 형광 리더 장치의 광학 구획에 통합된 ICCD(강화 전하 결합 소자) 카메라에 의해 결정됩니다. 이러한 RLU는 발광 다이오드(LED)(LED 출력 파장 470-495nm)에 의한 Ca²⁺ 민감 염료(fluo-2)의 여기로 인해 발생합니다. 8,000-10,000 RLU의 값이 이 응용 분야에 적합합니다. 필요한 경우 여기 강도(Select Exc. Intensity) 또는 카메라 게이트(Select Gate Open)를 변경하여 RLU를 조정할 수 있습니다. 플레이트에 대한 분산은 이상적으로는 7.5% 미만이어야 합니다.
6. 8,000-10,000 RLU의 배경 값을 얻은 경우 "업데이트"를 선택합니다. 저장 버튼을 클릭하여 기본 프로토콜을 저장합니다.
   메모: 이렇게 하면 프로토콜 신호 테스트의 설정이 메인 프로토콜로 전달됩니다.
7. "RUN" 버튼을 눌러 분석을 실행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플루오-2 AM	아브캠	AB142775	형광 Ca2+ 민감 염료
플루로닉 F-127	시그마	P2443-250G	플루론산
젤라틴	시그마	G9391
AMD3100	시그마	A5602-5 밀리그램	특정 CXCR4 길항제
마라비록	AnorMed의 친절한 선물		항레트로바이러스 약물, CCR5 길항제
케모카인 리간드 CXCL12	페프로텍	300-28ᅡ
케모카인 리간드 CCL5	페프로텍	300-06
소 태아 세럼(FBS)	Gibco(생명 기술)	10270-106
소 혈청 알부민(BSA)	시그마	A1933-25G
둘베코의 변형 독수리 배지(DMEM)	Gibco(생명 기술)	41965-039
HBSS (10 개), 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음	Gibco(생명 기술)	제14065-049
헤페스 (1M)	Gibco(생명 기술)	제15630-056
트립신-EDTA (0,25 %), 페놀 레드	Gibco(생명 기술)	제25200-056
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)	Gibco(생명 기술)	제14190-094
팔콘 튜브, 50 mL	Greiner 바이오 원	227 261
조직 배양 플라스크(T75)	코 닝	353024
블랙 플레이트, 96웰, 투명 바닥, 뚜껑 포함	코스타/피셔 사이언티픽	10530753	분석 플레이트(96-well), 세포 파종용
폴리프로필렌(PP) 플레이트	써모 사이언티픽(VWR)	Tel.: 732-2661	복합 플레이트와 케모카인 플레이트를 준비하는 데 사용되는 플레이트, 둥근 바닥
FLIPR Tetra 고처리량 세포 스크리닝 시스템	분자 장치		통합 피펫터 헤드와 ICCD 카메라가 있는 형광판 리더
FLIPR 테트라 LED 모듈 470 - 495 nm	분자 장치	제0200-6128	형광 Ca2+ 민감 염료의 여기를 위한 발광 다이오드
FLIPR 테트라 방출 필터 515 - 575 nm	분자 장치	제0200-6203	형광 염료와 호환되는 방출 필터
FLIPR 테트라 96 헤드	분자 장치	TEL.0310-4536	96웰 피펫터 헤드, 형광판 리더에 통합
스크린웍스	분자 장치		FLIPR Tetra에서 데이터 분석 및 시각화에 사용되는 소프트웨어 패키지
바이셀	벡크만 쿨터		세포 생존도 분석기
Corning CellBIND 96 웰 플랫 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트, 뚜껑 포함, 멸균	코 닝	3340	사전 코팅된 96웰 분석 플레이트는 분석 플레이트의 수동 코팅을 위한 대안이 될 수 있습니다.

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