α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제 효소 활성의 체외 측정

초록

출처: Lukas, J., et al. Fabry and Pompe Disease에서 약리학적 샤페론 반응성을 테스트하기 위한 체외 효소 측정. J. Vis. 특급 (2017)

이 동영상은 합성 4-메틸룸벨리페릴 기질을 사용하여 샘플에서 α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제에 대한 효소 활성의 체외 측정을 보여줍니다.

프로토콜

1. 세포 수확 및 α-갈락토시다아제 A 또는 산성 α-글루코시다아제 활성 측정

1. 세포 수확
   1. 수확 당일, 인큐베이터에서 세포를 제거하고 배지를 흡인합니다. Ca₂+ 및 Mg₂+.
      로 PBS로 세포를 2회 조심스럽게 세척합니다. 참고: DGJ와 DNJ는 각각 α-갈락토시다아제와 α-글루코시다아제의 강력한 억제제이며, 남은 약물이 있으면 검사가 무효화되기 때문에 이 단계가 중요합니다.
   2. 세포 위에 직접 200μL의 탈이온수를 추가합니다. 플레이트에서 세포를 헹구고 1.5mL 반응 튜브로 옮깁니다.

2. 동결 및 해동에 의한 균질화

1. 샘플을 적절한 폼 랙에 넣고 5초 동안 와류를 일으켜 용해를 보다 효율적으로 만듭니다. 샘플을 액체 질소에서 10초 동안 번갈아 가며 넣고 해동이 완료될 때까지(5분) 실온의 수조에 넣습니다.
2. 이 절차를 5회 반복한 다음 10,000 x g에서 5분 동안 샘플을 회전시킵니다.상층액과 피펫을 새 반응 튜브에 보관합니다.

3. bicinchoninic acid (BCA) 분석을 사용한 단백질 농도 측정

1. 40μL의 탈이온화된 H₂O를 포함하는 각 샘플에 대해 새 튜브를 준비하고 10μL의 샘플을 추가합니다. 간단히 볼텍싱하여 용액을 혼합하고 10μL를 96웰 플레이트의 캐비티로 옮깁니다(각 샘플은 3회). 표준 곡선을 얻기 위해 다음과 같이 2 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA) 원액을 탈이온화된 H₂O에 희석합니다: 50 μL H₂O/50 μL BSA; 60 μL H₂O/40 μL BSA; 70 μL H₂O/30 μL BSA; 80 μL H₂O/20 μL BSA; 90 μL H₂O/10 μL BSA; 100 μL H₂영형.
2. 200 μL의 BCA 시약(시약 A와 시약 B를 50:1 비율로 혼합)을 첨가하여 반응을 시작하고 오비탈 쉐이커(300 rpm)에서 약간의 교반으로 37 °C의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 플레이트 리더에서 560nm에서 흡광도를 측정합니다.
   메모: 샘플에는 일반적으로 μL당 1-1.5μg의 단백질이 포함되어 있습니다.

4. 인공 4-Methylumbelliferyl 기질(4-MUG)을 사용한 효소 활성 측정

1. 계산된 양의 각 샘플과 피펫을 새로운 1.5mL 반응 튜브에 희석하여 0.05(α-갈락토시다아제 A의 경우) 또는 0.5(산성 α-글루코시다아제의 경우) 단백질/μL 용액을 얻습니다. 샘플을 다시 5초 동안 볼렉스하고 이 희석액 10μL를 96웰 플레이트에 피펫팅합니다(각 샘플은 중복됨).
2. 20 μL의 각 기질 용액을 첨가하여 반응을 시작합니다 :
   α-갈락토시다아제 A의 경우: 0.06M 인산염 시트레이트 완충액에 2mM 4-메틸룸벨리페릴-α-D-갈락토피라노사이드(4-MU-gal), pH 4.7.
   산 α-글루코시다아제의 경우: 0.025M 아세트산 나트륨, pH 4.0에서 2mM 4-메틸룸벨리페릴 α-D-글루코피라노시드(4-MU-글루).
3. 효소 반응을 37°C의 어두운 곳에서 오비탈 쉐이커(300rpm)에서 약간 교반하면서 1시간 동안 배양합니다. 200 μL의 1.0 M, pH 10.5 조정 글리신-NaOH 완충액을 첨가하여 반응을 종료합니다.
4. 다음과 같이 0.01 mg/mL 스톡에서 4-methylumbelliferone(4-MU)의 표준 곡선을 준비합니다
   100 μL H2O/ 4-MU 없음; 80 μL H2O/ 20 μL 4-MU; 60 μL H₂O/ 40 μL 4-MU; 40 μL_{H 2}O/ 60 μL 4-MU; 20 μL H₂O/ 80 μL 4-MU; no H₂O/ 100 μL 4-MU, 각 희석액 10 μL를 96 웰 플레이트(중복)에 피펫하고 부피와 pH를 조정하기 위해 각 웰에 1.0 M 글리신-NaOH 완충액 200 μL를 추가합니다.
5. 적절한 필터 세트가 장착된 형광 리더에서 효소 활성을 측정하고 형광 리더 장치에 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
   메모: 두 4-MUG 기질은 모두 α-갈락토시다아제 A 또는 산성 α-글루코시다아제에 노출되는 동안 4-MU로 감소합니다. 출시된 4-MU는 형광 색소로, 마이크로플레이트 형광 리더를 사용하여 여기 파장과 방출 파장으로 각각 360 및 465 nm에서 측정할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소금	Merck, 다름슈타트, 독일	1,06,40,41,000
염화칼	Merck, 다름슈타트, 독일	1,04,93,60,500
마그네슘2 x 6H2O	Merck, 다름슈타트, 독일	1,05,83,30,250
D (+) - 포도당 일 수화물	Merck, 다름슈타트, 독일	1,08,34,22,500
수산화나트륨	Merck, 다름슈타트, 독일	1,06,49,80,500
아세트산나트륨	Merck, 다름슈타트, 독일	1,06,26,40,050
HEK293H 세포주	Invitrogen, 카를스루에, 독일	제11631-017
SafeSeal 반응 튜브, 1.5mL	Sarstedt, Nümbrecht, 독일	72,706
Tecan GENios 리더	Tecan, Männedorf, 스위스
마젤란 데이터 분석 소프트웨어 v6.6	Tecan, Männedorf, 스위스	해당 없음

륨 호