바이러스 불활성화 분석을 통한 항바이러스 테스트 화합물의 효과 평가

초록

출처: Tai, C. et al., 항바이러스 화합물의 식별 및 평가를 위한 조기 바이러스 진입 분석. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 바이러스 불활성화 분석을 보여주며, 바이러스 입자에 대한 항바이러스제의 영향 평가를 보여줍니다.

프로토콜

1. 바이러스 불활성화 분석

참고: 다양한 바이러스에 대한 잠복기 및 바이러스 선량의 예가 그림 1A에 나열되어 있습니다. MOI/PFU를 증가시켜 더 높은 농도의 바이러스를 테스트할 수도 있습니다.

1. 96웰 플레이트(웰당 1 ×^{10 4}개 셀)에 Huh-7.5 세포를 시드하고 5% CO₂ 인큐베이터 O/N에서 37°C에서 배양하여 단층을 얻습니다.
2. 테스트 화합물 또는 대조군을 배양합니다(최종 농도: CHLA = 50μM; 퍼그 = 50μM; 헤파린 = 1,000μg/ml; DMSO = 1%)을 37°C(그림 1A, '장기')에서 1:1 비율로 HCV 입자와 함께 사용합니다. 예를 들어, 1 x 104 FFU를 포함하는 100μl 바이러스 접종물에 100μM CHLA 작업 희석액 100μl를 첨가합니다. 이를 통해 50μM의 최종 농도에서 CHLA 처리를 수행할 수 있습니다.
3. 바이러스-약물 혼합물을 테스트 화합물의 "하위 치료용"(비효율적인) 농도로 희석합니다. 예를 들어, HCV에 대한 CHLA 및 PUG의 비효율적 농도는 1μM31입니다. 그러므로, 이를 위해서는 9.8ml의 기초 배지(2% FBS를 함유한 세포 배양 배지)로 달성할 수 있는 바이러스-약물 혼합물의 50배 희석이 필요합니다.
   참고: sub-therapeutic 농도로의 희석은 테스트 화합물과 숙주 세포 표면 사이의 중요한 상호 작용을 방지하고 cell-free virion에 대한 치료 효과를 검사할 수 있습니다. 이 희석은 특정 바이러스 감염에 대한 테스트 화합물의 항바이러스 용량 반응에 따라 달라지며 이 특정 분석을 수행하기 전에 결정됩니다.
4. 비교를 위해 바이러스를 테스트 화합물과 혼합하고 감염 전에 치료 미만 농도로 즉시 희석(잠복 기간 없음)합니다(그림 1A, '단기').
5. 희석된 HCV 약물 혼합물 100μl를 Huh-7.5 세포 단층(바이러스의 양은 현재 1 x 10² FFU, 최종 MOI = 0.01)에 첨가하고 37°C에서 3시간 동안 배양하여 바이러스 흡착을 허용합니다.
6. 감염 후 희석된 접종물을 제거하고 PBS 200μl로 우물을 두 번 부드럽게 씻습니다.
   메모: 세포가 들리지 않도록 부드럽게 세척하십시오.
7. 각 웰에 100μl의 기초 배지를 적용하고 37°C에서 72시간 동안 배양합니다.
8. 루시페라아제 활성에 대한 상층액을 분석하여 결과 감염을 분석합니다.

결과

그림 1. 테스트 화합물 CHLA 및 PUG에 의한 바이러스 감염의 비활성화. 상이한 바이러스를 37°C에서 장기간(적정 전 1.5 – 3시간 동안 배양, 밝은 회색 막대) 또는 단기간(즉시 희석, 짙은 회색 막대) 동안 테스트 화합물로 처리한 후 하위 치료 농도로 희석하고 각 숙주 세포에 대한 감염을 후속 분석했습니다. (A) 오른쪽 표의 각 바이러스에 대해 표시된 최종 바이러스 농도(PFU/웰 또는 MOI), 장기 바이러스-약물 배양 기간(i) 및 후속 배양 시간(ii)이 포함된 실험의 개략도(왼쪽 참조). (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11995-040
FBS(증권 시세	지브코	제26140-079
페니실린-스트렙토마이신	지브코	제15070-063
암포테리신 B	지브코	제15290-018
디엠소	시그마	D5879
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PBS 산도 7.4	지브코	10010023
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염화칼륨	시그마	P5405

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