숙주 세포의 바이러스 진입 및 융합에 대한 테스트 화합물의 효과를 평가하기 위한 분석

초록

출처: Tai, C., et al. 항바이러스 화합물의 식별 및 평가를 위한 조기 바이러스 진입 분석. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 바이러스가 숙주 세포로 진입하고 엔도솜과 융합하는 특정 단계를 표적으로 하는 항바이러스제를 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 저온에서 배양된 다음 HCV에 감염됩니다. 낮은 온도는 숙주 세포에 대한 바이러스 결합을 허용하지만 내포작용(endocytosis)을 통한 내재화를 억제합니다. 테스트 항바이러스 화합물을 첨가하고 세포를 생리학적 온도에서 배양합니다. 이러한 더 높은 온도로의 이동은 바이러스 진입을 용이하게 하고 엔도솜과의 바이러스 외피 융합에 대한 테스트 화합물의 영향을 평가할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 세포 배양 및 바이러스 감염과 관련된 모든 절차가 취급되는 샘플의 생물 안전성 수준에 적합한 인증된 생물 안전 후드에서 수행되도록 합니다. 프로토콜을 설명하기 위해 Gaussia luciferase 리포터 태그가 지정된 HCV가 모델 바이러스로 사용됩니다. 대표적인 결과의 맥락에서, 화합물 chebulagic acid(CHLA) 및 punicalagin(PUG)은 초기 바이러스 진입 단계에서 세포 표면 글리코사미노글리칸과 바이러스 당단백질 상호 작용을 표적으로 하는 후보 항바이러스제로 사용됩니다. 많은 바이러스의 침입을 방해하는 것으로 알려진 헤파린은 이러한 맥락에서 양성 대조군 치료제로 사용됩니다.

1. 세포 배양, 화합물 제제 및 복합 세포 독성

1. 분석할 바이러스 감염 시스템에 대한 각각의 세포주를 성장시킵니다(표 1). HCV의 경우, 10% 소 태아 혈청(FBS), 200 U/ml 페니실린 G, 200 μg/ml 스트렙토마이신 및 0.5 μg/ml 암포테리신 B가 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)에서 Huh-7.5 세포를 성장시킵니다.
2. 각각의 용매를 사용하여 테스트 화합물 및 대조군을 준비합니다 : 예를 들어, CHLA 및 PUG를 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 용해시킵니다. 멸균 이중 증류수에 헤파린을 준비합니다. 이후의 모든 희석에는 배양 배지를 사용하십시오.
   참고: 테스트 화합물 처리에서 DMSO의 최종 농도는 실험에서 1% 미만입니다. 1% DMSO는 비교를 위해 분석에 음성 대조군 처리로 포함됩니다.
3. XTT(2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide)와 같은 세포 생존율 측정 시약을 사용하여 바이러스 감염에 대한 세포에서 테스트 화합물(, 예: , CHLA 및 PUG)의 세포 독성을 측정합니다.
   1. HCV의 경우, 96웰 플레이트(웰당 1개 × 10⁴개 세포)에 Huh-7.5 세포를 시딩하고 5% CO₂ 인큐베이터 O/N에서 37°C에서 배양하여 단층을 얻습니다.
   2. DMSO 대조군(1%)을 적용하거나 테스트 화합물 CHLA 및 PUG(예: 0, 10, 50, 100 및 500μM)의 농도를 3회 배양 웰에 적용합니다.
   3. 37°C에서 72시간 동안 배양한 다음 플레이트에 배지를 버리고 200μl의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 두 번 세척합니다.
   4. XTT 기반 in vitro 독성 분석 키트의 분석 용액 100μl를 각 웰에 추가하고 플레이트를 37°C에서 3시간 더 배양하여 XTT 포르마잔을 생산할 수 있도록 합니다.
   5. 492nm의 테스트 파장과 690nm의 기준 파장에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정합니다.
   6. 세포 생존율(%) = At / As × 100%, 여기서 'At' 및 'As'는 각각 테스트 화합물의 흡광도와 용매 제어(예: 1% DMSO) 처리를 나타냅니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 GraphPad Prism과 같은 분석 소프트웨어에서 테스트 화합물의 50% 세포 독성(CC₅₀) 농도를 측정합니다.

2. 바이러스 감염 판독

참고: 바이러스 감염에 대한 판독은 사용되는 바이러스 시스템에 따라 다르며 플라크 분석 또는 리포터 태그가 지정된 바이러스의 리포터 신호 측정과 같은 방법이 포함될 수 있습니다. 루시페라제 리포터 활성을 기반으로 리포터-HCV 감염을 검출하는 방법은 다음과 같다.

1. 감염된 웰에서 상층액을 수집하고 17,000 x g의 마이크로 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 정화합니다.
2. Gaussia luciferase 분석 키트의 20μl의 테스트 상등액을 50μl의 luciferase 기질에 혼합하고 제조업체의 지침에 따라 광도계로 직접 측정합니다.
3. HCV 감염성을 바이러스 억제(%)를 결정하기 위한 상대 광 단위(RLU)의 로그₁₀로 표현하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 GraphPad Prism 소프트웨어의 알고리즘을 사용하여 HCV 감염에 대한 테스트 화합물의 50% 유효 농도(EC₅₀)를 계산합니다.

위치 3. 바이러스 진입/융합 분석

참고: 다양한 바이러스에 대한 잠복기 및 바이러스 투여량의 예는 그림 1A '진입/융합'에 나열되어 있습니다. MOI/PFU를 증가시켜 더 높은 농도의 바이러스를 테스트할 수도 있습니다.

1. 96웰 플레이트(웰당 1개 × 10⁴개 셀)에 Huh-7.5 세포를 파종하고 5% CO₂ 인큐베이터 O/N에서 37°C에서 배양하여 단층을 얻습니다.
2. 플레이트의 세포 단층을 4°C에서 1시간 동안 사전 냉각합니다.
3. 세포를 HCV(감염의 다중성, MOI = 0.01)로 4°C에서 3시간 동안 감염시킵니다. 예를 들어, 1 x 10² FFU(Focus forming Unit)를 포함하는 100μl 바이러스 접종물을 사용합니다.
   참고: 얼음에 바이러스 접종물을 첨가하고 4°C 냉장고에서 배양을 수행하여 온도를 4°C로 유지하면 바이러스 결합은 허용되지만 진입은 허용되지 않습니다.
4. 상층액을 제거하고 200μl의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포 단층을 두 번 부드럽게 세척합니다.
   참고: 세포가 들리지 않도록 부드럽게 세척하십시오.
5. 웰을 테스트 화합물 또는 대조군으로 처리합니다(최종 농도: CHLA = 50μM; 퍼그 = 50μM; 헤파린 = 1,000μg/ml; DMSO = 1%)를 사용하고 37°C에서 3시간 동안 배양합니다. 예를 들어, 90μl의 매체에 10μl의 500μM CHLA 작업 희석액을 추가하고 웰을 혼합 및 처리합니다. 이를 통해 50μM의 최종 농도에서 CHLA 처리를 수행할 수 있습니다.
   참고: 4°C에서 37°C로의 전환은 이제 바이러스 진입/융합 이벤트를 용이하게 하므로 이 특정 단계에 대한 테스트 화합물의 효과를 평가할 수 있습니다.
6. 약물 함유 상등액을 흡인하고 200μl의 구연산염 완충액(50mM 구연산나트륨, 4mM 염화칼륨, pH 3.0) 또는 PBS로 세척하여 내재화되지 않은 세포외 바이러스를 제거합니다. 37°C에서 72시간 동안 배양하기 전에 100μl의 기저 배지를 적용합니다.
7. '2에 설명된 대로 루시페라아제 활성에 대한 상등액을 분석하여 결과 감염을 분석합니다. 바이러스 감염 판독'.

결과

표 1: 바이러스 감염을 위한 숙주 세포 유형.대표 결과에 설명된 각 바이러스 감염 시스템에 사용된 세포 유형이 표시됩니다.

바이러스	셀 유형
HCMV	헬
HCV	응-7.5
덴브-2	베로
MV	쵸슬램
RSV	HEp-2

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	기브코	11995-040
FBS	기브코	26140-079
페니실린-스트렙토마이신	기브코	15070-063
암포테리신 B	기브코	15290-018
DMSO	시그마	D5879
체외 독성학 분석 키트, XTT 기반	시그마	톡스2
PBS pH 7.4	기브코	10010023
마이크로플레이트 리더	바이오텍 인스트루먼트 (Bio-Tek Instrument, Inc.)	ELx800
마이크로 원심분리기	써모사이언티픽	75002420
BioLux Gaussia luciferase 분석 키트	뉴잉글랜드 바이오랩	E3300L
광도계	프로메가	글로맥스-20/20
구연산나트륨, 이수화물	시그마	71402
염화칼륨	시그마	P5405