변형된 리트머스 테스트를 사용한 박테리아 바이오마커의 비색 검출

초록

출처: Tram, K., et al. 리트머스 테스트를 사용한 박테리아의 비색 검출. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 DNAzyme을 활성화하는 E. coli 바이오마커를 포함하는 비색 E. coli 검출 방법을 보여줍니다. 후속 비색 분석은 암모니아로 인한 pH 변화를 통해 E. coli 바이오마커를 검출합니다.

프로토콜

1. 검사를 위한 대장균 세포 준비

1. 원하는 세포 현탁액을 위해 배양된 스톡 1ml를 1.5ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.
2. 6,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
3. 10μl의 반응 완충액을 세포 펠렛에 추가하고 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 5분 동안 초음파 처리합니다. 세포 현탁액을 5분 동안 아이스박스에 옮깁니다.
4. 세포 현탁액을 5분 더 초음파 처리합니다.
5. 13,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.테스트를 위해 상등액(10μl)을 사용합니다.

2. 리트머스 테스트

1. 1.5ml 마이크로분리관에 100μl의 반응 완충액(RB)을 첨가 및 볼텍싱하고 완충액을 폐기하여 튜브를 사전 세척합니다.
2. 조립된 EC1 15μl를 세척된 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다.
3. 마이크로퓨지 튜브를 마그네틱 랙에 올려 마그네틱 비드를 세척합니다. 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 랙에서 마이크로분리 튜브를 제거하고 RB 100μl를 추가한 다음 마그네틱 비드를 조심스럽게 다시 매달아 놓습니다.
4. 2.3단계를 반복하여 MB를 두 번 더 세척합니다.
5. 마이크로fuge 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 상층액을 제거한 다음 1.3단계에서 준비한 10μl E. coli 샘플을 추가합니다.
6. 샘플과 마그네틱 비드를 마이크로분리 튜브를 부드럽게 두드려 조심스럽게 혼합합니다.
7. 반응을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
8. 반응에 90 μl의 ddH₂O를 첨가하고 마이크로 분리 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다.
9. 약 3분 동안 자기를 분리한 후 85μl의 상등액을 0.5ml 마이크로분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 자성 비드가 모이지 않도록 상등액을 천천히 빼냅니다.
10. 위의 마이크로 분리 튜브에 15 μl의 0.04 % 페놀 레드와 100 μl의 기판 용액을 첨가하십시오.
11. 색상 변화를 기록하기 위해 특정 시간 간격으로 사진을 찍습니다.
    메모: pH 변화는 미세 전극이 있는 pH 측정기를 사용하여 모니터링할 수도 있습니다. 시작 pH는 약 5.2-5.5 여야합니다 (용액은 노란색). 그렇지 않은 경우 1mM 아세테이트 완충액 pH 5.0)을 첨가하여 용액을 조정할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	VWR 암레스코	105
수산화나트륨(NaOH) 펠릿	바이오 베이직 캐나다 INC	SB6789
트리스 베이스	VWR 암레스코	497
요소	VWR 암레스코	엠123
자일렌시아놀 FF	시그마-알드리치	엑스-4126
0.04% 페놀 레드	시그마-알드리치	P3532
10x T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 완충액	루시젠	30061-1
대장균 K12 (MG1655)	증권 시세	ATCC700926
마그네틱 비드 (BioMag)	뱅스 래버러토리스 Inc
마그네틱 분리 랙	뉴잉글랜드 바이오랩스	S1506S
마이크로분리관	사르슈테트	72.69
세포 배양 인큐베이터	에펜도르프 사이언티픽	M13520000
Branson 초음파 세척기	브 랜 슨	해당 사항 없음